តើយើងគួរបន្ថែមគំរូប៉ុន្មានទៅក្នុងប្រតិកម្ម PCR របស់ខ្ញុំ?

ទោះបីជាតាមទ្រឹស្ដី ម៉ូលេគុលមួយនៃគំរូនឹងគ្រប់គ្រាន់ក៏ដោយ បរិមាណ DNA ធំជាងនេះត្រូវបានគេប្រើប្រាស់ជាធម្មតាសម្រាប់ PCR បុរាណ ឧទាហរណ៍រហូតដល់ 1 µg នៃ DNA ថនិកសត្វហ្សែន និង 1 pg នៃ plasmid DNA ។ ចំនួនដ៏ប្រសើរបំផុតអាស្រ័យទៅលើចំនួនច្បាប់ចម្លងនៃលំដាប់គោលដៅ ក៏ដូចជាភាពស្មុគស្មាញរបស់វា។

ប្រសិនបើគំរូតិចតួចត្រូវបានប្រើ ការកើនឡើងដែលត្រូវគ្នានៃចំនួនវដ្តនៃការពង្រីកនឹងត្រូវបានត្រូវការដើម្បីទទួលបានបរិមាណគ្រប់គ្រាន់នៃផលិតផល។ សារធាតុ Taq polymerase ដែលត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការពិសោធន៍ PCR ភាគច្រើនមិនមានមុខងារកែតម្រូវទេ (សកម្មភាព 3′-5′ exonuclease); ដូច្នេះ កំហុសដែលកើតឡើងកំឡុងពេល amplification មិនអាចកែបានឡើយ។ ចំនួនវដ្តកាន់តែខ្ពស់ ការពង្រីកផលិតផលដែលមានកំហុសនឹងកាន់តែរីករាលដាល។ ផ្ទុយទៅវិញ ប្រសិនបើបរិមាណនៃគំរូខ្ពស់ពេក ប្រូបាប៊ីលីតេនៃសារធាតុ primers ទៅនឹងលំដាប់ផ្សេងទៀត (មិនរាប់រយភាគរយ) ក៏ដូចជាការបង្កើត primer dimers នឹងកើនឡើង ដែលនឹងនាំឱ្យមានការពង្រីក។ អនុផល។ ក្នុង​ករណី​ជា​ច្រើន DNA ត្រូវ​បាន​បំបែក​ចេញ​ពី​វប្បធម៌​កោសិកា ឬ​ពី​អតិសុខុមប្រាណ ហើយ​បន្ទាប់​មក​ត្រូវ​បាន​ប្រើ​ជា​គំរូ PCR ។ បន្ទាប់ពីការបន្សុត វាចាំបាច់ក្នុងការកំណត់កំហាប់នៃ DNA ដើម្បីអាចកំណត់បរិមាណដែលត្រូវការសម្រាប់ការដំឡើង PCR ។ ខណៈពេលដែល agarose gel electrophoresis អាចបម្រើដើម្បីផ្តល់នូវការប៉ាន់ស្មាន វិធីសាស្ត្រនេះគឺនៅឆ្ងាយពីភាពត្រឹមត្រូវ។ UV-Vis spectrophotometry ត្រូវបានបង្កើតឡើងជាស្តង់ដារមាសសម្រាប់បរិមាណនៃអាស៊ីត nucleic; វិធីសាស្រ្តដោយផ្ទាល់ និងងាយស្រួល និងរហ័សនេះវាស់ស្ទង់ការស្រូបយកគំរូនៅ 260 nm ហើយកំហាប់ត្រូវបានគណនាដោយជំនួយពីកត្តាបំប្លែង។

ប្រសិនបើកំហាប់ DNA មានកម្រិតទាបខ្លាំង (< 1 µg/mL dsDNA) ឬប្រសិនបើវាត្រូវបានបំពុលដោយសារធាតុដែលស្រូបយកក្នុងជួរ 260 nm (ឧទាហរណ៍ RNA ប្រូតេអ៊ីន អំបិល) វិធីសាស្ត្រនេះនឹងឈានដល់កម្រិតកំណត់របស់វា។ ក្នុងករណីដែលមានកំហាប់ទាបខ្លាំង ការអាននឹងក្លាយទៅជាមិនត្រឹមត្រូវពេកក្នុងការប្រើប្រាស់ ហើយការចម្លងរោគនឹងនាំឱ្យមានការប៉ាន់ប្រមាណ (ជួនកាលដ៏ធំសម្បើម) នៃតម្លៃជាក់ស្តែង។ ក្នុងករណីនេះ បរិមាណដោយប្រើ fluorescence អាចបង្ហាញជម្រើសជំនួស។ បច្ចេកទេសនេះគឺផ្អែកលើការប្រើប្រាស់ថ្នាំជ្រលក់ fluorescent ដែលភ្ជាប់ជាពិសេសទៅនឹង dsDNA តែសារធាតុស្មុគស្មាញដែលមានអាស៊ីត nucleic និងថ្នាំជ្រលក់ត្រូវបានរំភើបដោយពន្លឺ ហើយវានឹងបញ្ចេញពន្លឺជាបន្តបន្ទាប់នៃរលកពន្លឺខ្ពស់ជាងបន្តិច។ នៅទីនេះអាំងតង់ស៊ីតេនៃសញ្ញា fluorescent គឺសមាមាត្រទៅនឹងបរិមាណ DNA ហើយសម្រាប់ការកំណត់កំហាប់វាត្រូវបានវាយតម្លៃទាក់ទងនឹងខ្សែកោងស្តង់ដារ។ គុណសម្បត្តិនៃវិធីសាស្រ្តនេះស្ថិតនៅលើភាពជាក់លាក់នៃចំណង ដែលមិនរាប់បញ្ចូលឥទ្ធិពលខាងក្រៅដែលបានណែនាំដោយការចម្លងរោគ ក៏ដូចជាសមត្ថភាពលទ្ធផលក្នុងការរកឃើញកំហាប់ DNA ទាបបំផុត។ ភាពស័ក្តិសមនៃវិធីសាស្រ្តទាំងពីរគឺអាស្រ័យជាចម្បងលើការប្រមូលផ្តុំគំរូ និងភាពបរិសុទ្ធ។ ក្នុង​ករណី​ជា​ច្រើន វា​អាច​នឹង​ត្រូវ​បាន​ណែនាំ​ឱ្យ​អនុវត្ត​វិធី​ទាំង​ពីរ​ស្រប​គ្នា។