Кіріспе
Нуклеин қышқылының экстракциясы дегеніміз не?
Ең қарапайым сөзбен айтқанда, нуклеин қышқылының экстракциясы үлгіден РНҚ және/немесе ДНҚ-ны және қажет емес барлық артық заттарды алып тастау болып табылады. Экстракция процесі нуклеин қышқылдарын үлгіден оқшаулайды және оларды еріткіштер мен ластаушы заттарсыз концентрлі элюат түрінде береді, олар кез келген төменгі ағынға әсер етуі мүмкін.
Нуклеин қышқылының экстракциясын қолдану
Тазартылған нуклеин қышқылдары әртүрлі салаларда әртүрлі қолданбалы салаларда қолданылады. Денсаулық сақтау - бұл әртүрлі сынақ мақсаттары үшін қажет тазартылған РНҚ және ДНҚ бар ең көп қолданылатын сала.
Нуклеин қышқылының экстракциясын денсаулық сақтауда қолдану мыналарды қамтиды:
- Келесі ұрпақ тізбегі (NGS)
- Күшейтуге негізделген SNP генотиптеу
- Массив негізіндегі генотиптеу
- Асқорытуды шектейтін фермент
- Модификациялаушы ферменттерді қолдану арқылы талдаулар (мысалы, байлау және клондау)
Сондай-ақ нуклеин қышқылының экстракциясы қолданылатын денсаулық сақтаудан тыс басқа салалар да бар, соның ішінде әке болуды анықтау, сот сараптамасы және геномика.
Нуклеин қышқылын алудың қысқаша тарихы
ДНҚ экстракциясы1869 жылы Фридрих Мишер есімді швейцариялық дәрігер жасаған бірінші белгілі оқшаулаумен ұзақ жолға қойылған. Мишер жасушалардың химиялық құрамын анықтау арқылы өмірдің негізгі принциптерін шешуге үміттенген. Лимфоциттермен сәтсіздікке ұшырағаннан кейін ол тасталған таңғыштардағы іріңнен табылған лейкоциттерден ДНҚ-ның шикі тұнбасын ала алды. Ол мұны жасуша цитоплазмасынан шығу үшін жасушаға қышқылды, содан кейін сілтіні қосу арқылы жасады, содан кейін ДНҚ-ны басқа белоктардан бөлу протоколын жасады.
Мишердің жаңашыл зерттеулерінен кейін көптеген басқа ғалымдар ДНҚ-ны оқшаулау және тазарту әдістерін дамытып, дамыта бастады. Эдвин Джозеф Кон, ақуыз ғалымы, Екінші дүниежүзілік соғыс кезінде ақуызды тазартудың көптеген әдістерін жасады. Ол қан плазмасының қан сарысуындағы альбуминдік фракциясын бөлуге жауапты болды, бұл қан тамырларындағы осмостық қысымды сақтауда маңызды. Бұл жауынгерлерді тірі қалдыру үшін өте маңызды болды.
1953 жылы Фрэнсис Крик Розалинд Франклин және Джеймс Уотсонмен бірге ДНҚ құрылымын анықтап, оның нуклеин қышқылы нуклеотидтерінің ұзын тізбектерінің екі тізбегінен тұратынын көрсетті. Бұл серпінді жаңалық 1958 жылғы эксперимент кезінде ДНҚ-ның жартылай консервативті репликациясын көрсете отырып, E. Coli бактерияларынан ДНҚ-ны бөліп алу үшін тығыздық градиентті центрифугалау протоколын жасай алған Месельсон мен Сталға жол ашты.
Нуклеин қышқылын алу техникасы
ДНҚ экстракциясының 4 кезеңі қандай?
Барлық экстракция әдістері бірдей негізгі қадамдарға дейін қайнатылады.
Жасушаның бұзылуы. Жасуша лизисі деп те аталатын бұл кезең қызықтыратын нуклеин қышқылдары бар жасушаішілік сұйықтықтарды шығару үшін жасуша қабырғасын және/немесе жасуша мембранасын бұзуды қамтиды.
Қажет емес қоқыстарды жою. Бұған мембраналық липидтер, белоктар және басқа да қажетсіз нуклеин қышқылдары кіреді, олар төменгі ағынды қолданбаларға кедергі келтіруі мүмкін.
Оқшаулау. Сіз жасаған тазартылған лизаттан қызығушылық тудыратын нуклеин қышқылдарын оқшаулаудың бірнеше түрлі жолдары бар, олар екі негізгі санатқа жатады: ерітінді негізіндегі немесе қатты күй (келесі бөлімді қараңыз).
Шоғырлану. Нуклеин қышқылдары барлық басқа ластаушы заттар мен еріткіштерден бөлініп алынғаннан кейін олар жоғары концентрлі элюат түрінде беріледі.
Экстракцияның екі түрі
Нуклеин қышқылын алудың екі түрі бар – ерітінді негізіндегі әдістер және қатты күй әдістері. Ерітіндіге негізделген әдіс химиялық экстракция әдісі ретінде де белгілі, өйткені ол жасушаны ыдырату және нуклеиндік материалға қол жеткізу үшін химиялық заттарды қолдануды қамтиды. Бұл фенол және хлороформ сияқты органикалық қосылыстарды немесе азырақ зиянды, сондықтан Proteinase K немесе силикагель сияқты көбірек ұсынылған бейорганикалық қосылыстарды пайдалану болуы мүмкін.
Жасушаны ыдырату үшін әртүрлі химиялық экстракция әдістерінің мысалдары мыналарды қамтиды:
- мембрананың осмостық жарылуы
- жасуша қабырғасының ферментативті қорытылуы
- мембрананы еріту
- Жуғыш заттармен
- Сілтілікпен өңдеумен
Механикалық әдістер деп те аталатын қатты күй әдістері ДНҚ қатты субстратпен қалай әрекеттесетінін пайдалануды қамтиды. ДНҚ байланысатын, бірақ талданатын зат қосылмайтын моншақ немесе молекуланы таңдау арқылы екеуін бөлуге болады. Қатты фазалы экстракция әдістерінің мысалдары, соның ішінде кремний диоксиді мен магниттік моншақтарды пайдалану.
Магниттік моншақ экстракциясы түсіндірілді
Магниттік моншақтарды алу әдісі
Магниттік моншақтарды қолданып алу мүмкіндігі алғаш рет Уайтхед институтының зерттеу мекемесіне Тревор Хокинс берген АҚШ патентінде танылды. Бұл патент генетикалық материалды магниттік моншақ болуы мүмкін қатты тірек тасымалдаушымен байланыстыру арқылы алуға болатынын мойындады. Принцип мынада: сіз генетикалық материал байланыстыратын жоғары функционалды магниттік моншақты пайдаланасыз, содан кейін үлгіні ұстап тұрған ыдыстың сыртына магниттік күш қолдану арқылы үстіңгі қабаттан бөлінуі мүмкін.
Неліктен магниттік моншақ экстракциясын пайдалану керек?
Магнитті моншақтарды алу технологиясы тез және тиімді экстракция процедураларына арналған әлеуетке байланысты барған сайын кең таралған. Соңғы уақытта нуклеин қышқылын алуды автоматтандыруға және өте ресурсты жеңіл әрі үнемді жұмыс процесіне мүмкіндік беретін қолайлы буферлік жүйелері бар жоғары функционалды магниттік моншақтар әзірленді. Сондай-ақ, магниттік моншақтарды алу әдістері ДНҚ-ның ұзағырақ бөліктерін бұзатын ығысу күштерін тудыруы мүмкін центрифугалау қадамдарын қамтымайды. Бұл ДНҚ-ның ұзағырақ тізбегі бұзылмай қалады дегенді білдіреді, бұл геномикалық тестілеуде маңызды.
Жіберу уақыты: 25 қараша 2022 ж