Теориялық тұрғыдан шаблонның бір молекуласы жеткілікті болса да, классикалық ПТР үшін, мысалы, 1 мкг геномдық сүтқоректілердің ДНҚ-сына дейін және плазмидтік ДНҚ-ның 1 пг-ға дейін аздаған ДНҚ-ның едәуір көп мөлшері пайдаланылады. Оңтайлы сома негізінен мақсатты реттілік көшірмелерінің санына, сондай-ақ оның күрделілігіне байланысты.
Үлгі өте аз пайдаланылса, өнімнің жеткілікті мөлшерін алу үшін күшейту циклдерінің санын сәйкес арттыру қажет болады. ПТР эксперименттерінің көпшілігі үшін қолданылатын Taq полимеразада түзету функциясы жоқ (3′-5′ экзонуклеаза белсенділігі); осылайша, күшейту кезінде орын алған қателерді түзету мүмкін емес. Циклдар саны неғұрлым көп болса, ақаулы өнімнің күшейтілуі соғұрлым көп болады. Егер, керісінше, шаблон мөлшері тым жоғары болса, праймерлердің басқа (жүз пайыз қосымша емес) реттіліктерге жасыту ықтималдығы, сондай-ақ праймер димерлерінің түзілу ықтималдығы артады, бұл жанама өнімдер. Көптеген жағдайларда ДНҚ жасуша дақылдарынан немесе микроорганизмдерден бөлініп алынады және кейіннен ПТР үлгісі ретінде пайдаланылады. Тазартудан кейін ПТР орнатуға қажетті көлемді анықтау үшін ДНҚ концентрациясын анықтау қажет. Агарозды гель электрофорезі бағалауды қамтамасыз ету үшін қызмет етуі мүмкін, бірақ бұл әдіс дәл емес. Нуклеин қышқылдарының мөлшерін анықтаудың алтын стандарты ретінде UV-Vis спектрофотометриясы белгіленді; бұл тікелей, сондықтан оңай және жылдам әдіс үлгінің 260 нм-де жұтылуын өлшейді және концентрация конверсия коэффициентінің көмегімен есептеледі.
Егер ДНҚ концентрациясы өте төмен болса (< 1 мкг/мл dsDNA) немесе ол 260 нм диапазонында сіңетін заттармен (мысалы, РНҚ, ақуыз, тұздар) ластанған болса, бұл әдіс өзінің шектеулеріне жетеді. Өте төмен концентрациялар жағдайында көрсеткіштер көп ұзамай пайдалану үшін тым дәл емес болады және ластанулар нақты мәнді асыра бағалауға (кейде орасан зор) әкеледі. Бұл жағдайда флуоресценция көмегімен сандық анықтау балама болуы мүмкін. Бұл әдіс dsDNA-мен арнайы байланысатын флуоресцентті бояуды қолдануға негізделген, ол тек нуклеин қышқылынан тұратын кешен және бояғыш жарықпен қоздырады және ол кейіннен сәл жоғары толқын ұзындығының сәулесін шығарады. Мұнда флуоресцентті сигналдың қарқындылығы ДНҚ мөлшеріне пропорционалды, ал концентрацияны анықтау үшін стандартты қисыққа қатысты бағаланады. Бұл әдістің артықшылығы ластану арқылы енгізілген сыртқы әсерлерді болдырмайтын байланыстың ерекшелігіне, сондай-ақ нәтижесінде ДНҚ-ның өте төмен концентрациясын анықтау мүмкіндігіне негізделген. Кез келген әдістің жарамдылығы негізінен үлгі концентрациясы мен тазалығына байланысты; көп жағдайда тіпті екі әдісті де қатар қолдану орынды болуы мүмкін.
Жіберу уақыты: 30 қараша 2022 ж