კრიოვიალებიჩვეულებრივ გამოიყენება უჯრედული ხაზების და სხვა კრიტიკული ბიოლოგიური მასალების კრიოგენული შესანახად, თხევადი აზოტით სავსე დევარებში.

თხევად აზოტში უჯრედების წარმატებით შენარჩუნებაში ჩართულია რამდენიმე ეტაპი. მიუხედავად იმისა, რომ ძირითადი პრინციპი არის ნელი გაყინვა, გამოყენებული ზუსტი ტექნიკა დამოკიდებულია უჯრედის ტიპზე და გამოყენებულ კრიოპროტექტორზე. არსებობს რამდენიმე უსაფრთხოების მოსაზრება და საუკეთესო პრაქტიკა, რომლებიც გასათვალისწინებელია უჯრედების ასეთ დაბალ ტემპერატურაზე შენახვისას.

ეს პოსტი მიზნად ისახავს მიმოხილვას, თუ როგორ ინახება კრიოვიალები თხევად აზოტში.

რა არის კრიოვიალები

კრიოვიალები არის პატარა, თავსახურიანი ფლაკონები, რომლებიც შექმნილია თხევადი ნიმუშების შესანახად უკიდურესად დაბალ ტემპერატურაზე. ისინი უზრუნველყოფენ, რომ კრიოპროტექტორში შენახული უჯრედები არ მოვიდეს უშუალო კონტაქტში თხევად აზოტთან, რაც ამცირებს უჯრედული მოტეხილობების რისკს, თუმცა სარგებლობს თხევადი აზოტის უკიდურესი გამაგრილებელი ეფექტით.

ფლაკონები, როგორც წესი, ხელმისაწვდომია მოცულობისა და დიზაინის დიაპაზონში - ისინი შეიძლება იყოს შიგნიდან ან გარედან ხრახნიანი ბრტყელი ან მომრგვალებული ფსკერით. ასევე ხელმისაწვდომია სტერილური და არასტერილური ფორმატები.

ვინც იყენებსკიროვიალებიუჯრედების შენახვა თხევად აზოტში

მთელი რიგი NHS და კერძო ლაბორატორიები, ასევე კვლევითი ინსტიტუტები, რომლებიც სპეციალიზირებულნი არიან ტვინის სისხლის ბანკირებაში, ეპითელური უჯრედების ბიოლოგიაში, იმუნოლოგიასა და ღეროვანი უჯრედების ბიოლოგიაში, იყენებენ კრიოვიალებს უჯრედების კრიოკონსერვაციის მიზნით.

ამ გზით შენახულ უჯრედებს მიეკუთვნება B და T უჯრედები, CHO უჯრედები, ჰემატოპოეტური ღეროვანი და წინამორბედი უჯრედები, ჰიბრიდომები, ნაწლავის უჯრედები, მაკროფაგები, მეზენქიმული ღეროვანი და წინამორბედი უჯრედები, მონოციტები, მიელომა, NK უჯრედები და პლურიპოტენტური ღეროვანი უჯრედები.

მიმოხილვა, თუ როგორ უნდა შეინახოთ კრიოვიალები თხევად აზოტში

კრიოკონსერვაცია არის პროცესი, რომელიც ინარჩუნებს უჯრედებს და სხვა ბიოლოგიურ კონსტრუქციებს მათი ძალიან დაბალ ტემპერატურამდე გაგრილებით. უჯრედები შეიძლება ინახებოდეს თხევად აზოტში წლების განმავლობაში, უჯრედის სიცოცხლისუნარიანობის დაკარგვის გარეშე. ეს არის გამოყენებული პროცედურების მონახაზი.

უჯრედის მომზადება

ნიმუშების მომზადების ზუსტი მეთოდი განსხვავდება უჯრედის ტიპის მიხედვით, მაგრამ ზოგადად, უჯრედები გროვდება და ცენტრიფუგირდება უჯრედებით მდიდარი მარცვლების შესაქმნელად. შემდეგ ეს მარცვლები ხელახლა ჩერდება ზენატანტში, რომელიც შერეულია კრიოპროტექტორთან ან კრიოკონსერვაციის გარემოში.

კრიოკონსერვაციის საშუალება

ეს გარემო გამოიყენება უჯრედების შესანარჩუნებლად დაბალ ტემპერატურულ გარემოში, რომელსაც ისინი დაექვემდებარებიან შიდა და უჯრედგარე კრისტალების წარმოქმნის და, შესაბამისად, უჯრედის სიკვდილის ინჰიბირებით. მათი როლი არის უჯრედებისა და ქსოვილებისთვის უსაფრთხო, დამცავი გარემოს უზრუნველყოფა გაყინვის, შენახვისა და დათბობის პროცესების დროს.

გარემო, როგორიცაა ახლად გაყინული პლაზმა (FFP), ჰეპარიზირებული პლაზმალიტის ხსნარი ან შრატისგან თავისუფალი, ცხოველური კომპონენტებისგან თავისუფალი ხსნარები შერეულია კრიოპროტექტორებთან, როგორიცაა დიმეთილ სულფოქსიდი (DMSO) ან გლიცეროლი.

ხელახლა გათხევადებული ნიმუშის მარცვლები ნაწილდება პოლიპროპილენის კრიოვიალებში, როგორიცააSuzhou Ace ბიოსამედიცინო კომპანია Cryogenic Storage Vials.

მნიშვნელოვანია, რომ არ მოხდეს კრიოვიალების ზედმეტად შევსება, რადგან ეს გაზრდის გახეთქვის რისკს და შიგთავსის შესაძლო გათავისუფლებას (1).

კონტროლირებადი გაყინვის მაჩვენებელი

ზოგადად, ნელი კონტროლირებადი გაყინვის სიჩქარე გამოიყენება უჯრედების წარმატებული კრიოკონსერვაციისთვის.

მას შემდეგ, რაც ნიმუშები გადანაწილდება კრიოგენულ ფლაკონებში, ისინი მოთავსებულია სველ ყინულზე ან 4℃ მაცივარში და გაყინვის პროცედურა იწყება 5 წუთის განმავლობაში. როგორც ზოგადი სახელმძღვანელო, უჯრედები გაცივებულია -1-დან -3 წუთში სიჩქარით (2). ეს მიიღწევა პროგრამირებადი გამაგრილებლის გამოყენებით ან ფლაკონების მოთავსებით იზოლირებულ ყუთში, რომელიც მოთავსებულია -70°C-დან -90°C-მდე კონტროლირებადი სიჩქარით საყინულეში.

გადატანა თხევად აზოტზე

შემდეგ გაყინული კრიოგენული ფლაკონები გადადის თხევადი აზოტის ავზში განუსაზღვრელი ვადით, თუ შენარჩუნებულია -135℃-ზე ნაკლები ტემპერატურა.

ამ ულტრა დაბალი ტემპერატურის მიღება შესაძლებელია თხევადი ან ორთქლის ფაზის აზოტში ჩაძირვით.

თხევადი თუ ორთქლის ფაზა?

ცნობილია, რომ თხევადი ფაზის აზოტის შენახვა ცივ ტემპერატურას აბსოლუტური თანმიმდევრულობით ინარჩუნებს, მაგრამ ხშირად არ არის რეკომენდებული შემდეგი მიზეზების გამო:

• თხევადი აზოტის დიდი მოცულობის (სიღრმის) საჭიროება, რაც პოტენციურ საფრთხეს წარმოადგენს. ამის გამო დამწვრობა ან ასფიქსია რეალური რისკია.
• ინფექციური აგენტებით ჯვარედინი დაბინძურების დოკუმენტირებული შემთხვევები, როგორიცაა ასპერგილუსი, ჰეპ B და ვირუსული გავრცელება თხევადი აზოტის საშუალებით (2,3)
• ჩაძირვისას ფლაკონებში თხევადი აზოტის გაჟონვის პოტენციალი. როდესაც საცავიდან ამოღებულია და ოთახის ტემპერატურამდე თბება, აზოტი სწრაფად ფართოვდება. შესაბამისად, ფლაკონი შეიძლება დაიმსხვრას თხევადი აზოტის საცავიდან მოხსნისას, რაც საფრთხეს უქმნის როგორც მფრინავ ნამსხვრევებს, ასევე შიგთავსის ზემოქმედებას (1, 4).

ამ მიზეზების გამო, ულტრა დაბალ ტემპერატურაზე შენახვა ყველაზე ხშირად ორთქლის ფაზის აზოტშია. როდესაც ნიმუშები უნდა ინახებოდეს თხევად ფაზაში, უნდა იქნას გამოყენებული სპეციალიზებული cryoflex მილები.

ორთქლის ფაზის უარყოფითი მხარე ის არის, რომ ვერტიკალური ტემპერატურის გრადიენტი შეიძლება მოხდეს, რაც იწვევს ტემპერატურის მერყეობას -135℃-დან -190℃-მდე. ეს მოითხოვს თხევადი აზოტის დონისა და ტემპერატურის ცვალებადობის ფრთხილად და გულმოდგინე მონიტორინგს (5).

ბევრი მწარმოებელი გვირჩევს, რომ კრიოვიალები შესაფერისია -135℃-მდე შესანახად ან მხოლოდ ორთქლის ფაზაში გამოსაყენებლად.

თქვენი კრიოკონსერვირებული უჯრედების დათბობა

დათბობის პროცედურა სტრესულია გაყინული კულტურისთვის და საჭიროა სათანადო დამუშავება და ტექნიკა, რათა უზრუნველყოს უჯრედების ოპტიმალური სიცოცხლისუნარიანობა, აღდგენა და ფუნქციონირება. დათბობის ზუსტი პროტოკოლები დამოკიდებული იქნება უჯრედების სპეციფიკურ ტიპებზე. თუმცა, სწრაფი დათბობა სტანდარტად ითვლება:

• შეამცირეთ ნებისმიერი გავლენა უჯრედების აღდგენაზე
• დაეხმარეთ გაყინულ მედიაში არსებულ ხსნარებთან ექსპოზიციის დროის შემცირებას
• შეამცირეთ ნებისმიერი ზიანი ყინულის რეკრისტალიზაციის შედეგად

ნიმუშების დათბობისთვის ჩვეულებრივ გამოიყენება წყლის აბაზანები, მძივების აბაზანები ან სპეციალიზებული ავტომატური ინსტრუმენტები.

ყველაზე ხშირად, 1 უჯრედის ხაზი დნება ერთდროულად 1-2 წუთის განმავლობაში, ნაზად მორევით 37℃ წყლის აბაზანაში, სანამ ფლაკონში ცოტაოდენი ყინული დარჩება, სანამ ისინი წინასწარ გახურებულ ზრდის საშუალებაში გაირეცხება.

ზოგიერთი უჯრედისთვის, როგორიცაა ძუძუმწოვრების ემბრიონები, ნელი დათბობა აუცილებელია მათი გადარჩენისთვის.

უჯრედები ახლა მზად არიან უჯრედების კულტურისთვის, უჯრედების იზოლაციისთვის, ან ჰემატოპოეზური ღეროვანი უჯრედების შემთხვევაში - სიცოცხლისუნარიანობის კვლევებისთვის, რათა უზრუნველყონ დონორი ღეროვანი უჯრედების მთლიანობა მიელოაბლაციურ თერაპიამდე.

ნორმალური პრაქტიკაა წინასწარ გარეცხილი ნიმუშის მცირე ნაწილის აღება, რომელიც გამოიყენება უჯრედების დათვლის შესასრულებლად, რათა განისაზღვროს უჯრედების კონცენტრაცია კულტურაში დასაფენად. ამის შემდეგ შეგიძლიათ შეაფასოთ უჯრედების იზოლაციის პროცედურების შედეგები და განსაზღვროთ უჯრედის სიცოცხლისუნარიანობა.

საუკეთესო პრაქტიკა კრიოვიალის შენახვისათვის

კრიოვიალებში შენახული ნიმუშების წარმატებული კრიოკონსერვაცია დამოკიდებულია პროტოკოლის ბევრ ელემენტზე, მათ შორის სათანადო შენახვასა და ჩანაწერების შენახვაზე.

• უჯრედების გაყოფა შენახვის ადგილებს შორის– თუ მოცულობები საშუალებას იძლევა, გაყავით უჯრედები ფლაკონებს შორის და შეინახეთ ისინი ცალკეულ ადგილას, რათა შემცირდეს ნიმუშის დაკარგვის რისკი მოწყობილობის გაუმართაობის გამო.
• თავიდან აიცილეთ ჯვარედინი დაბინძურება- აირჩიეთ ერთჯერადი სტერილური კრიოგენული ფლაკონები ან ავტოკლავი შემდგომ გამოყენებამდე
• გამოიყენეთ შესაბამისი ზომის ფლაკონები თქვენი უჯრედებისთვის- ფლაკონები მოცულობის დიაპაზონშია 1-დან 5 მლ-მდე. მოერიდეთ ფლაკონების ზედმეტ შევსებას, რათა შემცირდეს ბზარის რისკი.
• აირჩიეთ შიდა ან გარე ხრახნიანი კრიოგენული ფლაკონები– ზოგიერთი უნივერსიტეტი რეკომენდირებულია შიდა ხრახნიანი ფლაკონების მიერ უსაფრთხოების ზომებისთვის – მათ ასევე შეუძლიათ თავიდან აიცილონ დაბინძურება შევსებისას ან თხევად აზოტში შენახვისას.
• გაჟონვის თავიდან აცილება- გამოიყენეთ ხრახნიან თავსახურში ან ო-რგოლებში ჩამოსხმული ორმაგი ინექციური ბეჭდები, რათა თავიდან აიცილოთ გაჟონვა და დაბინძურება.
• გამოიყენეთ 2D შტრიხკოდები და ეტიკეტების ფლაკონები– მიკვლევადობის უზრუნველსაყოფად, ფლაკონები დიდი საწერი უბნებით საშუალებას აძლევს თითოეულ ფლაკანს ადეკვატური იყოს ეტიკეტირებული. 2D შტრიხკოდებს შეუძლიათ დაგეხმაროთ შენახვის მენეჯმენტში და ჩანაწერების შენახვაში. ფერადი კოდირებული ქუდები სასარგებლოა ადვილი იდენტიფიკაციისთვის.
• ადეკვატური შენახვის შენარჩუნება- იმისათვის, რომ უჯრედები არ დაიკარგოს, შესანახი ჭურჭელი მუდმივად უნდა აკონტროლოს ტემპერატურა და თხევადი აზოტის დონე. სიგნალიზაცია უნდა იყოს დამონტაჟებული შეცდომების შესახებ მომხმარებლების გასაფრთხილებლად.

უსაფრთხოების ზომები

თხევადი აზოტი გახდა ჩვეულებრივი პრაქტიკა თანამედროვე კვლევებში, მაგრამ არასწორად გამოყენების შემთხვევაში იწვევს სერიოზული დაზიანების რისკს.

თხევადი აზოტის გამოყენებისას ყინვების, დამწვრობის და სხვა არასასურველი ინციდენტების რისკის შესამცირებლად უნდა იქნას გამოყენებული სათანადო პერსონალური დამცავი მოწყობილობა (PPE). აცვიათ

• კრიოგენული ხელთათმანები
• ლაბორატორიული ქურთუკი
• დარტყმის მდგრადი სრული სახის ფარი, რომელიც ასევე ფარავს კისერს
• დახურული ფეხსაცმელი
• ნაპერწკლგაუმტარი პლასტიკური წინსაფარი

თხევადი აზოტის მაცივრები უნდა განთავსდეს კარგად ვენტილირებად ადგილებში, რათა მინიმუმამდე შემცირდეს ასფიქსიის რისკი - გამოტოვებული აზოტი ორთქლდება და ცვლის ატმოსფერულ ჟანგბადს. დიდი მოცულობის მაღაზიებს უნდა ჰქონდეს დაბალი ჟანგბადის სიგნალიზაცია.

თხევადი აზოტის გამოყენებისას წყვილებში მუშაობა იდეალურია და მისი გამოყენება ნორმალური სამუშაო საათების გარეთ უნდა აიკრძალოს.

Cryovials თქვენი სამუშაო პროცესის მხარდასაჭერად

Suzhou Ace Biomedical კომპანია გთავაზობთ პროდუქციის ფართო არჩევანს, რომელიც აკმაყოფილებს თქვენს კრიოკონსერვაციის საჭიროებებს სხვადასხვა ტიპის უჯრედებისთვის. პორტფოლიო მოიცავს მილისა და სტერილური კრიოვიალების მთელ რიგს.

ჩვენი კრიოვიალებია:

• ლაბორატორიული ხრახნიანი თავსახური 0.5 მლ 1.5 მლ 2.0 მლ კრიოვიალური კრიოგენული ფლაკონები კონუსური ქვედა კრიოტუბი შუასადებით

  ● 0.5 მლ, 1.5 მლ, 2.0 მლ სპეციფიკაცია, კალთით ან კალთის გარეშე
  ● ხელმისაწვდომია კონუსური ან თვითდამდგარი დიზაინი, სტერილური ან არასტერილური
  ● ხრახნიანი თავსახურის მილები დამზადებულია სამედიცინო ხარისხის პოლიპროპილენისგან
  ● PP Cryotube ფლაკონი შეიძლება განმეორებით გაიყინოს და გალღობდეს
  ●გარე ქუდის დიზაინს შეუძლია შეამციროს დაბინძურების ალბათობა ნიმუშის დამუშავების დროს.
  ● ხრახნიანი კრიოგენური მილები უნივერსალური ხრახნიანი ძაფები გამოსაყენებლად
  ● მილები ერგება ყველაზე გავრცელებულ როტორებს
  ● კრიოგენური მილის o-ring მილები ერგება სტანდარტულ 1-დიუმიან და 2-დიუმიან, 48 ჭაბურღილში, 81 ჭაბურღილს, 96 ჭაბურღილს და 100 ჭაბურღილის საყინულე ყუთებს
  ● ავტოკლავირებადია 121°C-მდე და გაყინვა -86°C-მდე

  ნაწილი NO	მასალა	მოცულობა	CAPფერი	PCS/ჩანთა	ჩანთები/ქეისი
  ACT05-BL-N	PP	0.5 მლ	შავი, ყვითელი, ლურჯი, წითელი, იასამნისფერი, თეთრი	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1.5 მლ	შავი, ყვითელი, ლურჯი, წითელი, იასამნისფერი, თეთრი	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1.5 მლ	შავი, ყვითელი, ლურჯი, წითელი, იასამნისფერი, თეთრი	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2.0 მლ	შავი, ყვითელი, ლურჯი, წითელი, იასამნისფერი, თეთრი	500	10