მიუხედავად იმისა, რომ თეორიულად, შაბლონის ერთი მოლეკულა საკმარისი იქნება, დნმ-ის მნიშვნელოვნად უფრო დიდი რაოდენობა ჩვეულებრივ გამოიყენება კლასიკური PCR-სთვის, მაგალითად, ძუძუმწოვრების გენომის 1 მკგ-მდე და პლაზმური დნმ-ის 1 პგ-მდე. ოპტიმალური რაოდენობა დიდწილად დამოკიდებულია სამიზნე თანმიმდევრობის ასლების რაოდენობაზე, ასევე მის სირთულეზე.
თუ შაბლონი ძალიან ცოტაა გამოყენებული, საკმარისი რაოდენობის პროდუქტის მისაღებად საჭირო იქნება გამაძლიერებელი ციკლების რაოდენობის შესაბამისი ზრდა. Taq პოლიმერაზა, რომელიც გამოიყენება PCR ექსპერიმენტების უმეტესობისთვის, არ გააჩნია კორექტირების ფუნქცია (3'-5' ეგზონუკლეაზას აქტივობა); ამრიგად, გაძლიერების დროს წარმოქმნილი შეცდომების გამოსწორება შეუძლებელია. რაც უფრო მეტია ციკლების რაოდენობა, მით უფრო გავრცელებული იქნება ნაკლოვანებული პროდუქტის გაძლიერება. თუ, მეორე მხრივ, შაბლონის რაოდენობა ძალიან მაღალია, პრაიმერების სხვა (არა ასი პროცენტით დამატებითი) თანმიმდევრობების შედუღების ალბათობა, ისევე როგორც პრაიმერის დიმერების წარმოქმნა, გაიზრდება, რაც გამოიწვევს გაძლიერებას. ქვეპროდუქტები. ხშირ შემთხვევაში, დნმ იზოლირებულია უჯრედული კულტურებიდან ან მიკროორგანიზმებიდან და შემდგომში გამოიყენება PCR შაბლონად. გაწმენდის შემდეგ, საჭიროა განისაზღვროს დნმ-ის კონცენტრაცია, რათა განვსაზღვროთ მოცულობა, რომელიც საჭიროა PCR დაყენებისთვის. მიუხედავად იმისა, რომ აგაროზის გელის ელექტროფორეზი შეიძლება შეფასდეს, ეს მეთოდი არ არის ზუსტი. UV-Vis სპექტროფოტომეტრია დადგენილია, როგორც ოქროს სტანდარტი ნუკლეინის მჟავების რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის; ეს პირდაპირი და, შესაბამისად, მარტივი და სწრაფი მეთოდი ზომავს ნიმუშის შთანთქმას 260 ნმ-ზე და კონცენტრაცია გამოითვლება კონვერტაციის ფაქტორის დახმარებით.
თუმცა, თუ დნმ-ის კონცენტრაცია ძალიან დაბალია (< 1 მკგ/მლ dsDNA), ან თუ ის დაბინძურებულია ნივთიერებებით, რომლებიც ასევე შთანთქავენ 260 ნმ დიაპაზონში (მაგ. რნმ, ცილა, მარილები), ეს მეთოდი მიაღწევს თავის შეზღუდვებს. ძალიან დაბალი კონცენტრაციის შემთხვევაში, ჩვენებები მალე გახდება ზედმეტად არაზუსტი გამოსაყენებლად და დაბინძურება გამოიწვევს (ზოგჯერ უზარმაზარ) ფაქტობრივი მნიშვნელობის გადაჭარბებულ შეფასებას. ამ შემთხვევაში, რაოდენობრივი განსაზღვრა ფლუორესცენციის გამოყენებით შეიძლება იყოს ალტერნატივა. ეს ტექნიკა დაფუძნებულია ფლუორესცენტური საღებავის გამოყენებაზე, რომელიც სპეციალურად აკავშირებს dsDNA-ს, მხოლოდ კომპლექსი, რომელიც შეიცავს ნუკლეინის მჟავას და საღებავი აღგზნებულია შუქით და შემდგომში ის გამოსცემს ოდნავ უფრო მაღალი ტალღის სიგრძის შუქს. აქ ფლუორესცენტური სიგნალის ინტენსივობა პროპორციულია დნმ-ის რაოდენობისა და კონცენტრაციის დასადგენად იგი ფასდება სტანდარტული მრუდის მიმართ. ამ მეთოდის უპირატესობები ემყარება კავშირის სპეციფიკას, რომელიც გამორიცხავს დაბინძურების შედეგად წარმოქმნილ გარე ზემოქმედებას, ასევე დნმ-ის ძალიან დაბალი კონცენტრაციის გამოვლენის უნარს. რომელიმე მეთოდის ვარგისიანობა ძირითადად დამოკიდებულია ნიმუშის კონცენტრაციაზე და სისუფთავეზე; ხშირ შემთხვევაში შეიძლება მიზანშეწონილი იყოს ორივე მეთოდის პარალელურად გამოყენება.
გამოქვეყნების დრო: ნოე-30-2022