Sanajan miturut teori, siji molekul cithakan bakal cukup, jumlah DNA sing luwih gedhe biasane digunakake kanggo PCR klasik, contone, nganti 1 µg DNA mamalia genomik lan mung 1 pg DNA plasmid. Jumlah optimal gumantung banget marang jumlah salinan urutan target, uga ing kerumitan.
Yen cithakan cilik banget digunakake, perlu kanggo nambah jumlah siklus amplifikasi sing cocog kanggo entuk produk sing cukup. Polimerase Taq sing digunakake kanggo umume eksperimen PCR ora nduweni fungsi koreksi (aktivitas exonuclease 3′-5′); mangkono, kasalahan dumadi sak amplifikasi ora bisa didandani. Sing luwih dhuwur jumlah siklus, luwih umum amplifikasi produk cacat. Yen, ing tangan liyane, jumlah cithakan dhuwur banget, kemungkinan primer anil menyang urutan liyane (ora satus persen gratis), uga pembentukan dimer primer, bakal nambah, sing bakal nyebabake amplifikasi. produk sampingan. Ing pirang-pirang kasus, DNA diisolasi saka kultur sel utawa saka mikroorganisme lan banjur digunakake minangka cithakan PCR. Sawise pemurnian, perlu kanggo nemtokake konsentrasi DNA supaya bisa nemtokake volume sing dibutuhake kanggo persiyapan PCR. Nalika elektroforesis gel agarose bisa nyedhiyakake perkiraan, cara iki adoh saka akurat. Spektrofotometri UV-Vis wis ditetepake minangka standar emas kanggo kuantifikasi asam nukleat; cara langsung lan mulane gampang lan cepet iki ngukur absorbance saka sampel ing 260 nm, lan konsentrasi wis diwilang karo bantuan saka faktor konversi.
Yen konsentrasi DNA sithik banget, nanging (< 1 µg/mL dsDNA), utawa yen terkontaminasi karo zat-zat sing uga nyerep ing kisaran 260 nm (contone RNA, protein, uyah), cara iki bakal tekan watesane. Ing kasus konsentrasi sing sithik banget, wacan kasebut bakal dadi ora akurat banget kanggo digunakake, lan kontaminasi bakal nyebabake (kadhangkala gedhe banget) ngira-ngira nilai sing nyata. Ing kasus iki, kuantifikasi nggunakake fluoresensi bisa menehi alternatif. Teknik iki adhedhasar panggunaan pewarna fluoresensi sing ngiket khusus karo dsDNA mung kompleks sing ngemot asam nukleat lan pewarna sing digayuh dening cahya, lan banjur bakal ngetokake cahya kanthi dawa gelombang sing rada dhuwur. Ing kene, intensitas sinyal fluoresensi sebanding karo jumlah DNA, lan kanggo nemtokake konsentrasi kasebut dievaluasi ing hubungane karo kurva standar. Kauntungan saka metode iki gumantung ing kekhususan ikatan, sing ora kalebu pengaruh eksternal sing disebabake dening kontaminasi, uga kemampuan kanggo ndeteksi konsentrasi DNA sing sithik banget. Kecocokan saka salah siji cara gumantung utamané ing konsentrasi sampel lan kemurnian; ing akeh kasus malah bisa dianjurake kanggo aplikasi loro cara ing podo karo.
Wektu kirim: Nov-30-2022