クライオバイアル液体窒素を満たしたデュワー中で、細胞株やその他の重要な生物学的材料を極低温保管するために一般的に使用されます。

液体窒素中での細胞の保存を成功させるには、いくつかの段階が必要です。基本原理はゆっくりと凍結することですが、使用される正確な技術は使用する細胞の種類と凍結保護剤によって異なります。このような低温でセルを保管する場合、考慮すべき安全上の考慮事項とベストプラクティスがいくつかあります。

この投稿の目的は、クライオバイアルが液体窒素中でどのように保管されるかについて概要を説明することです。

クライオバイアルとは

クライオバイアルは、液体サンプルを極低温で保存するために設計された、キャップ付きの小型バイアルです。これらは、凍結保護剤に保存された細胞が液体窒素と直接接触しないことを保証し、液体窒素の極度の冷却効果の恩恵を受けながら、細胞破壊のリスクを最小限に抑えます。

バイアルは通常、さまざまな容量とデザインで入手可能です。バイアルには、平らな底または丸い底を備えた内ねじまたは外ねじが付いています。滅菌および非滅菌フォーマットも利用可能です。

誰が使用するかシロバイアル液体窒素中で細胞を保存する

さまざまな NHS および民間研究所、さらに臍帯血バンク、上皮細胞生物学、免疫学、幹細胞生物学を専門とする研究機関は、細胞を凍結保存するためにクライオバイアルを使用しています。

この方法で保存される細胞には、B細胞およびT細胞、CHO細胞、造血幹細胞および前駆細胞、ハイブリドーマ、腸細胞、マクロファージ、間葉幹細胞および前駆細胞、単球、骨髄腫、NK細胞、および多能性幹細胞が含まれます。

クライオバイアルを液体窒素中で保存する方法の概要

凍結保存は、細胞やその他の生物学的構造物を非常に低い温度に冷却することによって保存するプロセスです。細胞は、細胞の生存能力を損なうことなく、液体窒素中で何年も保存できます。これは採用された手順の概要です。

細胞の準備

サンプルを調製するための正確な方法は細胞の種類によって異なりますが、一般的には細胞を収集し、遠心分離して細胞が豊富なペレットを生成します。次に、このペレットを凍結保護剤または凍結保存媒体と混合した上清に再懸濁します。

凍結保存培地

この培地は、細胞内および細胞外の結晶の形成、ひいては細胞死を阻害することにより、細胞がさらされる低温環境で細胞を保存するために使用されます。その役割は、凍結、保管、解凍のプロセス中に細胞と組織に安全な保護環境を提供することです。

新鮮凍結血漿（FFP）、ヘパリン添加血漿溶液、または無血清、動物性成分を含まない溶液などの培地を、ジメチルスルホキシド（DMSO）やグリセロールなどの凍結保護剤と混合します。

再液化されたサンプルペレットは、次のようなポリプロピレン製クライオバイアルに等分されます。蘇州エースバイオメディカル会社 極低温保存バイアル.

ひび割れや内容物の放出の可能性が高まるため、クライオバイアルを過剰に充填しないことが重要です (1)。

凍結速度の制御

一般に、細胞の凍結保存を成功させるには、ゆっくりと制御された凍結速度が使用されます。

サンプルを極低温バイアルに小分けした後、濡れた氷の上または 4℃ の冷蔵庫に置き、5 分以内に凍結手順を開始します。一般的なガイドとして、セルは 1 分あたり -1 ～ -3 の速度で冷却されます (2)。これは、プログラム可能な冷却器を使用するか、-70°C ～ -90°C に制御された速度冷凍庫に置かれた断熱ボックスにバイアルを入れることによって実現されます。

液体窒素に移す

凍結した極低温バイアルは、-135℃未満の温度が維持される限り、無期限に液体窒素タンクに移されます。

これらの超低温は、液体または気相窒素に浸漬することによって得ることができます。

液相か気相か?

液相窒素での保管は、絶対的な一貫性を保って低温を維持できることが知られていますが、次の理由により推奨されないことがよくあります。

• 潜在的な危険を伴う大量（深さ）の液体窒素の必要性。これによる火傷や窒息は非常に危険です。
• アスペルギルス、ヘプB、液体窒素媒体を介して広がるウイルスなどの感染因子による相互汚染の文書化された事例 (2、3)
• 浸漬中に液体窒素がバイアルに漏れる可能性。保管場所から取り出して室温まで温めると、窒素は急速に膨張します。その結果、液体窒素保管庫から取り出すときにバイアルが粉砕する可能性があり、破片の飛来と内容物の露出の両方による危険が生じます (1、4)。

これらの理由により、超低温保管は気相窒素中で行われるのが最も一般的です。サンプルを液相で保存する必要がある場合は、特殊なクライオフレックス チューブを使用する必要があります。

気相の欠点は、垂直方向の温度勾配が発生し、-135℃ ～ -190℃ の間で温度変動が生じる可能性があることです。このため、液体窒素のレベルと温度変化を注意深く注意深く監視する必要があります (5)。

多くのメーカーは、クライオバイアルが -135℃ までの保管、または気相でのみの使用に適していることを推奨しています。

凍結保存した細胞を解凍する

凍結培養物にとって解凍手順はストレスがかかり、細胞の最適な生存率、回復、機能を確保するには適切な取り扱いと技術が必要です。正確な解凍プロトコルは、特定の細胞の種類によって異なります。ただし、次の場合には急速解凍が標準とみなされます。

• 細胞の回復に対する影響を軽減する
• 凍結媒体中に存在する溶質にさらされる時間を短縮します。
• 氷の再結晶によるダメージを最小限に抑える

サンプルの解凍には、ウォーターバス、ビーズバス、または特殊な自動機器が一般的に使用されます。

最も頻繁に行われるのは、バイアル内にほんの少しの氷が残るまで 37℃ のウォーターバス内で穏やかにかき回すことにより、1 つの細胞株を一度に 1 ～ 2 分間解凍してから、予熱した増殖培地で洗浄することです。

哺乳類の胚など一部の細胞では、ゆっくりと温めることが生存のために不可欠です。

細胞は現在、細胞培養、細胞単離、または造血幹細胞の場合、骨髄破壊療法の前にドナー幹細胞の完全性を保証するための生存率研究の準備が整っています。

培養でプレーティングする細胞濃度を決定するために細胞数を測定するために使用される、前洗浄されたサンプルの少量のアリコートを採取するのが通常の方法です。その後、細胞分離手順の結果を評価し、細胞の生存率を判断できます。

クライオバイアルの保管に関するベストプラクティス

クライオバイアルに保存されたサンプルの冷凍保存が成功するかどうかは、適切な保管や記録の保管など、プロトコルの多くの要素に依存します。

• 保管場所間でセルを分割する– 容量が許せば、細胞をバイアルに分割し、別々の場所に保管して、機器の故障によるサンプル損失のリスクを軽減します。
• 相互汚染の防止– 次回使用する前に、使い捨て滅菌極低温バイアルまたはオートクレーブを選択します
• 細胞に適したサイズのバイアルを使用する– バイアルには 1 ～ 5ml の範囲の容量があります。ひび割れのリスクを軽減するため、バイアルを過剰に充填しないでください。
• 内ネジまたは外ネジ付きの極低温バイアルを選択してください– 安全対策として、一部の大学では雌ねじ付きバイアルを推奨しています。充填時や液体窒素中での保管時の汚染も防止できます。
• 漏れを防ぐ- 漏れや汚染を防ぐために、スクリューキャップまたは O リングに成形された二重射出シールを使用します。
• 2D バーコードを使用してバイアルにラベルを付ける– トレーサビリティを確保するため、書き込み領域が広いバイアルにより、各バイアルに適切なラベルを付けることができます。 2D バーコードは、保管管理と記録保持に役立ちます。色分けされたキャップは識別しやすくするのに役立ちます。
• 適切な保管メンテナンス- 細胞が失われないように、保管容器は温度と液体窒素レベルを常に監視する必要があります。ユーザーにエラーを警告するためにアラームを取り付ける必要があります。

安全上の注意事項

液体窒素は現代の研究では一般的に行われていますが、誤って使用すると重傷を負う危険があります。

液体窒素を取り扱う際は、凍傷、火傷、その他の有害な事故のリスクを最小限に抑えるために、適切な個人用保護具 (PPE) を着用する必要があります。着る

• 極低温手袋
• 白衣
• 首もカバーする耐衝撃性フルフェイスシールド
• つま先が閉じた靴
• 防滴プラスチックエプロン

液体窒素冷凍機は、窒息のリスクを最小限に抑えるために、換気の良い場所に設置する必要があります。漏れた窒素は気化し、大気中の酸素と置き換わります。大規模店舗には低酸素警報システムを設置する必要があります。

液体窒素を扱うときは二人一組で作業することが理想的であり、通常の作業時間外に液体窒素を使用することは禁止されるべきです。

ワークフローをサポートするクライオバイアル

蘇州エースバイオメディカル社は、さまざまな種類の細胞の凍結保存ニーズを満たす幅広い製品を提供しています。ポートフォリオには、さまざまなチューブとさまざまな滅菌クライオバイアルが含まれています。

当社のクライオバイアルは次のとおりです。

• ラボ用スクリューキャップ 0.5mL 1.5mL 2.0mL クライオバイアル 極低温バイアル ガスケット付き円錐底クライオチューブ

  ●0.5ml、1.5ml、2.0ml仕様、スカートあり、スカートなし
  ●円錐形または自立型デザイン、滅菌または非滅菌の両方が利用可能
  ●スクリューキャップチューブは医療グレードのポリプロピレン製です。
  ●PP製クライオチューブバイアルは凍結融解を繰り返し可能です。
  ●外部キャップ設計によりサンプル処理時のコンタミ確率を低減できます。
  ●スクリューキャップ極低温管 ユニバーサルネジで使用可能
  ● チューブはほとんどの一般的なローターに適合します
  ● 極低温チューブ O リング チューブは、標準の 1 インチおよび 2 インチ、48 ウェル、81 ウェル、96 ウェル、100 ウェル冷凍ボックスに適合します。
  ●121℃までオートクレーブ可能、-86℃まで冷凍可能。

  部品番号	材料	音量	キャップ色	個/バッグ	バッグ/ケース
  ACT05-BL-N	PP	0.5ML	黒、黄、青、赤、紫、白	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1.5ML	黒、黄、青、赤、紫、白	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1.5ML	黒、黄、青、赤、紫、白	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2.0ML	黒、黄、青、赤、紫、白	500	10