理論的には、テンプレートの1つの分子で十分であり、たとえば最大1 µgのゲノム哺乳類DNAと1 pgのプラスミドDNAなど、古典的なPCRにはかなり多くのDNAが使用されます。最適な量は、ターゲットシーケンスのコピー数とその複雑さに大きく依存します。
テンプレートが非常に少ない場合、十分な量の製品を取得するには、増幅サイクルの数の対応する増加が必要になります。ほとんどのPCR実験に使用されるTAQポリメラーゼは、補正関数（3'-5 'エキソヌクレアーゼ活性）を特徴としていません。したがって、増幅中に発生するエラーを修正することはできません。サイクルの数が多いほど、欠陥のある製品の増幅がより一般的になります。一方、テンプレートの量が高すぎると、プライマーが他の（100％の無料の）シーケンスにアニーリングする確率、およびプライマー二量体の形成が増加し、結果として増幅されます。副産物。多くの場合、DNAは細胞培養または微生物から分離され、その後PCRテンプレートとして使用されます。精製に続いて、PCRセットアップに必要な体積を定義できるように、DNAの濃度を決定する必要があります。アガロースゲル電気泳動は推定を提供するのに役立つかもしれませんが、この方法は正確ではありません。 UV-vis分光測光測定は、核酸の定量化のゴールドスタンダードとして確立されています。この直接的で簡単かつ迅速なメソッドは、260 nmでのサンプルの吸光度を測定し、濃度は変換係数の助けを借りて計算されます。
ただし、DNA濃度が非常に低い場合（<1 µg/ml DSDNA）、または260 nmの範囲（RNA、タンパク質、塩など）にも吸収される物質で汚染されている場合、この方法はその制限に達します。非常に低い濃度の場合、測定値はすぐに不正確になりすぎて使用するには不正確になり、汚染は実際の値の（時には巨大な）過大評価につながります。この場合、蛍光を使用した定量化は代替案を提示する場合があります。この手法は、核酸を含む複合体のみを特異的にdsDNAに結合する蛍光色素の使用に基づいており、色素は光に興奮し、その後わずかに高い波長の光を放出します。ここでは、蛍光シグナルの強度はDNAの量に比例し、濃度を決定するために標準曲線に関連して評価されます。この方法の利点は、結合の特異性に基づいており、これは汚染によって導入された外部の影響、および非常に低い濃度のDNAを検出する能力を除外します。いずれかの方法の適合性は、主にサンプル濃度と純度に依存します。多くの場合、両方の方法を並行して適用することをお勧めします。
投稿時間：2022年11月30日