קריוביאליםמשמשים בדרך כלל לאחסון קריוגני של קווי תאים וחומרים ביולוגיים קריטיים אחרים, בדוארים מלאים בחנקן נוזלי.

ישנם מספר שלבים המעורבים בשימור מוצלח של תאים בחנקן נוזלי. בעוד שהעיקרון הבסיסי הוא הקפאה איטית, הטכניקה המדויקת המופעלת תלויה בסוג התא ובחומר ההגנה מפני קריו המשמשים. ישנם מספר שיקולי בטיחות ושיטות עבודה מומלצות שיש לקחת בחשבון בעת ​​אחסון תאים בטמפרטורות נמוכות כל כך.

פוסט זה נועד לתת סקירה כללית של האופן שבו קוביות קריוביות מאוחסנות בחנקן נוזלי.

מה הם קריוביאלים

Cryovials הם בקבוקונים קטנים עם מכסה המיועדים לאחסון דגימות נוזליות בטמפרטורות נמוכות במיוחד. הם מבטיחים שתאים שנשמרו ב-cryoprotectant לא באים במגע ישיר עם החנקן הנוזלי, וממזערים את הסיכון לשברים בתאים, תוך שהם עדיין נהנים מהשפעת הקירור הקיצונית של חנקן נוזלי.

הבקבוקונים זמינים בדרך כלל במגוון נפחים ועיצובים - ניתן להשחיל אותם פנימית או חיצונית עם תחתית שטוחה או מעוגלת. פורמטים סטריליים ולא סטריליים זמינים גם כן.

מי משתמשצירוביאליםלאחסן תאים בחנקן נוזלי

מגוון של NHS ומעבדות פרטיות, כמו גם מוסדות מחקר המתמחים בבנקאות דם טבורי, ביולוגיה של תאי אפיתל, אימונולוגיה וביולוגיה של תאי גזע משתמשים ב-cryovials כדי לשמר תאים.

תאים שנשמרו בדרך זו כוללים תאי B ו-T, תאי CHO, תאי גזע ואב המטופואטים, היברידומות, תאי מעיים, מקרופאגים, תאי גזע ואב מזנכימליים, מונוציטים, מיאלומה, תאי NK ותאי גזע פלוריפוטנטיים.

סקירה כללית של איך לאחסן קריוביאלים בחנקן נוזלי

שימור הקפאה הוא תהליך המשמר תאים ומבנים ביולוגיים אחרים על ידי קירורם לטמפרטורות נמוכות מאוד. ניתן לאחסן תאים בחנקן נוזלי במשך שנים ללא אובדן של כדאיות התא. זהו מתווה של הנהלים שננקטו.

הכנת תאים

השיטה המדויקת להכנת דגימות תשתנה בהתאם לסוג התא, אך באופן כללי, התאים נאספים ומצונטרים לפיתוח גלולה עשירה בתאים. לאחר מכן, גלולה זו מושהה מחדש בסופרנטנט מעורבב עם חומר מגן קריו או מדיום לשימור.

מדיום להקפאה

המדיום הזה משמש לשימור תאים בסביבות הטמפרטורה הנמוכות שהם יהיו נתונים להן על ידי עיכוב היווצרות של גבישים תוך וחוץ תאיים ומכאן מוות תאים. תפקידם לספק סביבה בטוחה ומגינה לתאים ורקמות במהלך תהליכי ההקפאה, האחסון וההפשרה.

מדיום כגון פלזמה קפואה טריה (FFP), תמיסת פלזמהליט בהפריניזציה או תמיסות ללא נסיוב ללא רכיבים מהחי, מעורבב עם חומרי הגנה מפני קריו כגון דימתיל סולפוקסיד (DMSO) או גליצרול.

גלולת הדגימה המנוזלת מחדש מנותקת לתוך פוליפרופילן cryovials כגוןחברת Suzhou Ace Biomedical Cryogenic Storage Vials.

חשוב לא למלא יתר על המידה את ה-cryovials מכיוון שהדבר יגדיל את הסיכון להיסדק ולשחרור אפשרי של תוכן (1).

קצב הקפאה מבוקר

באופן כללי, קצב הקפאה מבוקר איטי משמש לשימור מוצלח של תאים.

לאחר חלוקה של דגימות לבקבוקונים קריוגניים, הם מונחים על קרח רטוב או במקרר 4℃ והליך ההקפאה מתחיל תוך 5 דקות. כמדריך כללי, תאים מקוררים בקצב של -1 עד -3 לדקה (2). זה מושג באמצעות מצנן ניתן לתכנות או על ידי הנחת בקבוקונים בקופסה מבודדת הממוקמת במקפיא בקצב מבוקר של -70°C עד -90°C.

מעבירים לחנקן נוזלי

הבקבוקונים הקריוגניים הקפואים מועברים לאחר מכן למיכל חנקן נוזלי לתקופות בלתי מוגבלות בתנאי שטמפרטורה של פחות מ-135℃ נשמרת.

ניתן להשיג טמפרטורות נמוכות במיוחד אלו על ידי טבילה בחנקן הנוזלי או באדי.

שלב נוזל או אדים?

אחסון בחנקן שלב נוזלי ידוע כשומר על הטמפרטורה הקרה בעקביות מוחלטת, אך לרוב אינו מומלץ מהסיבות הבאות:

• הצורך בנפחים גדולים (עומק) של חנקן נוזלי המהווה סכנה פוטנציאלית. כוויות או חנק עקב כך הם סיכון ממשי.
• מקרים מתועדים של זיהום צולב על ידי גורמים זיהומיים כמו אספרגילוס, hep B והתפשטות ויראלית דרך המדיום חנקן נוזלי (2,3)
• הפוטנציאל של דליפת חנקן נוזלי לתוך הבקבוקונים במהלך הטבילה. כאשר מוציאים אותו מהאחסון ומחממים אותו לטמפרטורת החדר, החנקן מתרחב במהירות. כתוצאה מכך, הבקבוקון עלול להתנפץ כאשר הוא מוסר מאחסון חנקן נוזלי, וליצור סכנה הן מהפסולת המעופפת והן מהחשיפה לתוכן (1, 4).

מסיבות אלה, אחסון בטמפרטורה נמוכה במיוחד הוא לרוב בחנקן פאזת אדים. כאשר יש לאחסן דגימות בשלב הנוזל, יש להשתמש בצינורות cryoflex מיוחדים.

החיסרון של שלב האדים הוא ששיפוע טמפרטורה אנכי יכול להתרחש וכתוצאה מכך תנודות טמפרטורה בין -135 ℃ ל -190 ℃. זה מצריך ניטור זהיר וחרוץ של רמות החנקן הנוזלי וריאציות הטמפרטורה (5).

יצרנים רבים ממליצים ש-cryovials מתאימים לאחסון עד -135℃ או לשימוש בשלב האדים בלבד.

הפשרת התאים השמורים שלך

הליך ההפשרה מלחיץ עבור תרבית קפואה, ונדרשים טיפול וטכניקה נכונים כדי להבטיח כדאיות, התאוששות ותפקוד מיטביים של התאים. פרוטוקולי ההפשרה המדויקים יהיו תלויים בסוגי תאים ספציפיים. עם זאת, הפשרה מהירה נחשבת סטנדרטית ל:

• הפחת כל השפעה על התאוששות סלולרית
• עזור להפחית את זמן החשיפה למומסים הנמצאים במדיה המקפיאה
• צמצם כל נזק על ידי התגבשות קרח מחדש

אמבטיות מים, אמבטיות חרוזים או מכשירים אוטומטיים מיוחדים משמשים בדרך כלל להפשרת דגימות.

לרוב, קו תאים אחד מופשר בכל פעם למשך 1-2 דקות, על ידי ערבוב עדין באמבט מים של 37℃ עד שנותרה רק מעט קרח קטן בבקבוקון לפני שהם נשטפים במצע גידול שחומם מראש.

עבור תאים מסוימים כמו עוברי יונקים, התחממות איטית חיונית להישרדותם.

התאים מוכנים כעת לתרבית תאים, בידוד תאים, או במקרה של תאי גזע המטופואטיים - מחקרי כדאיות להבטחת שלמות תאי הגזע התורמים לפני טיפול מיאלואבלטיבי.

זה נוהג נורמלי לקחת מנות קטנות של הדגימה השטופה מראש המשמשת לביצוע ספירת תאים כדי לקבוע ריכוזי תאים לציפוי בתרבית. לאחר מכן תוכל להעריך את התוצאות של הליכי בידוד תאים ולקבוע את כדאיות התא.

שיטות עבודה מומלצות לאחסון קוביות קריוביות

שמירת הקפאה מוצלחת של דגימות המאוחסנות ב-cryobials תלויה באלמנטים רבים בפרוטוקול כולל אחסון נאות ושמירת תיעוד.

• פיצול תאים בין מיקומי אחסון- אם הנפחים מאפשרים, פצל תאים בין בקבוקונים ואחסן אותם במקומות נפרדים כדי להפחית את הסיכון לאובדן דגימה עקב כשלים בציוד.
• למנוע זיהום צולב- בחר בבקבוקונים קריוגניים סטריליים לשימוש חד פעמי או חיטוי לפני השימוש הבא
• השתמש בבקבוקונים בגודל מתאים עבור התאים שלך- הבקבוקונים מגיעים בטווח של נפחים בין 1 ל-5 מ"ל. הימנע ממילוי יתר של בקבוקונים כדי להפחית את הסיכון להיסדק.
• בחר בקבוקונים קריוגניים עם הברגה פנימית או חיצונית- בקבוקונים עם הברגה פנימית מומלצים על ידי כמה אוניברסיטאות לאמצעי בטיחות - הם יכולים גם למנוע זיהום במהלך המילוי או כאשר הם מאוחסנים בחנקן הנוזלי.
• מניעת דליפה- השתמש באטמים מוזרקים יצוקים לתוך מכסה הברגה או טבעות O כדי למנוע דליפה וזיהום.
• השתמש בברקודים דו-ממדיים ובבקבוקוני תוויות- כדי להבטיח עקיבות, בקבוקונים עם שטחי כתיבה גדולים מאפשרים לכל בקבוקון להיות מסומן הולם. ברקודים דו מימדיים יכולים לעזור בניהול אחסון ושמירת רישומים. כובעים מקודדים בצבע שימושיים לזיהוי קל יותר.
• תחזוקת אחסון נאותה- כדי להבטיח שהתאים לא יאבדו, כלי אחסון צריכים לפקח כל הזמן על הטמפרטורה ורמות החנקן הנוזלי. יש להתקין אזעקות כדי להתריע על שגיאות.

אמצעי בטיחות

חנקן נוזלי הפך לפרקטיקה נפוצה במחקר מודרני אך טומן בחובו סיכון לפציעה חמורה אם נעשה בו שימוש לא נכון.

יש ללבוש ציוד מגן אישי (PPE) מתאים כדי למזער את הסיכון של כוויות קור, כוויות ואירועים שליליים אחרים בעת טיפול בחנקן נוזלי. לִלבּוֹשׁ

• כפפות קריוגניות
• מעיל מעבדה
• מגן פנים מלא עמיד בפני פגיעות המכסה גם את הצוואר
• נעליים סגורות
• סינר פלסטיק עמיד בפני התזה

מקררי חנקן נוזלי צריכים להיות ממוקמים באזורים מאווררים היטב כדי למזער את הסיכון לחנק - חנקן שנפלט מתאדה ועוקר חמצן אטמוספרי. בחנויות בנפח גדול צריכות להיות מערכות אזעקת חמצן נמוכות.

עבודה בזוגות בעת טיפול בחנקן נוזלי היא אידיאלית ויש לאסור את השימוש בו מחוץ לשעות העבודה הרגילות.

קריוביאלים לתמיכה בזרימת העבודה שלך

חברת Suzhou Ace Biomedical מציעה מבחר רחב של מוצרים העונים על צורכי שימור ההקפאה שלך עבור סוגים שונים של תאים. הפורטפוליו כולל מגוון של צינורות וכן מגוון של בקבוקונים סטריליים.

הקרובילים שלנו הם:

• מכסה בורג מעבדה 0.5 מ"ל 1.5 מ"ל 2.0 מ"ל בקבוקונים קריוגניים קריוביאליים בקבוקונים קריוגניים תחתונים חרוטיים עם אטם

  ● מפרט 0.5 מ"ל, 1.5 מ"ל, 2.0 מ"ל, עם חצאית או בלי חצאית
  ● עיצוב חרוטי או עצמאי, סטרילי או לא סטרילי זמינים שניהם
  ● צינורות מכסה בורג עשויים מפוליפרופילן ברמה רפואית
  ● בקבוקוני PP Cryotube ניתן להקפיא ולהפשיר שוב ושוב
  ● עיצוב המכסה החיצוני יכול להפחית את ההסתברות לזיהום במהלך טיפול בדגימה.
  ● צינורות קריוגניים עם מכסה בורג ברגים אוניברסליים לשימוש
  ● צינורות מתאימים לרוב הרוטורים הנפוצים
  ● צינורות o-ring צינור קריוגניים מתאימים לקופסאות מקפיא סטנדרטיות בגודל 1 אינץ' ו-2 אינץ', 48 באר, 81 באר, 96 באר ו-100 באר
  ● ניתן לאוטוקלאב עד 121°C וניתן להקפאה עד -86°C

  חלק מס	חוֹמֶר	כֶּרֶך	כּוֹבַעצֶבַע	PCS/תִיק	תיקים/מארז
  ACT05-BL-N	PP	0.5 מ"ל	שחור, צהוב, כחול, אדום, סגול, לבן	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1.5 מ"ל	שחור, צהוב, כחול, אדום, סגול, לבן	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1.5 מ"ל	שחור, צהוב, כחול, אדום, סגול, לבן	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2.0 מ"ל	שחור, צהוב, כחול, אדום, סגול, לבן	500	10