מיצוי חומצת גרעין ושיטת החרוזים המגנטיים

מָבוֹא

מהי מיצוי חומצת גרעין?

במונחים הפשוטים ביותר, מיצוי חומצת גרעין היא הסרה של ה-RNA ו/או ה-DNA מדגימה וכל העודף שאינו הכרחי. תהליך המיצוי מבודד את חומצות הגרעין מדגימה ומניב אותן בצורה של eluate מרוכז, ללא מדללים ומזהמים שעלולים להשפיע על כל יישומים במורד הזרם.

יישומים של מיצוי חומצת גרעין

חומצות גרעין מטוהרות משמשות בשפע של יישומים שונים, הנעים על פני מספר תעשיות שונות. שירותי בריאות הם אולי האזור שבו נעשה בו שימוש רב, עם RNA ו-DNA מטוהרים הנדרשים למגוון מטרות בדיקות שונות.

יישומים של מיצוי חומצת גרעין בתחום הבריאות כוללים:

- הגברה של PCR ו-qPCR

- רצף הדור הבא (NGS)

- גנוטייפ SNP מבוסס הגברה

- גנוטייפ מבוסס מערך

- עיכול אנזים הגבלה

- ניתוח באמצעות אנזימים משתנים (כגון קשירה ושיבוט)

ישנם גם תחומים אחרים מעבר לבריאות שבהם נעשה שימוש במיצוי חומצת גרעין, כולל אך לא רק בדיקות אבהות, זיהוי פלילי וגנומיקה.

היסטוריה קצרה של מיצוי חומצת גרעין

מיצוי DNAתחילתו של דרך ארוכה, כשהבידוד הידוע הראשון בוצע על ידי רופא שוויצרי בשם פרידריך מישר בשנת 1869. מישר קיווה לפתור את העקרונות הבסיסיים של החיים על ידי קביעת ההרכב הכימי של התאים. לאחר שנכשל עם לימפוציטים, הוא הצליח להשיג משקע גולמי של DNA מלוקוציטים שנמצאו במוגלה על תחבושות שהושלכו. הוא עשה זאת על ידי הוספת חומצה ואז אלקלי לתא כדי לעזוב את הציטופלזמה של התא, ואז פיתח פרוטוקול להפרדת ה-DNA מהחלבונים האחרים.

בעקבות המחקר פורץ הדרך של מישר, מדענים רבים אחרים המשיכו להתקדם ולפתח טכניקות לבידוד וטיהור DNA. אדווין ג'וזף קון, מדען חלבונים פיתח טכניקות רבות לטיהור חלבון במהלך מלחמת העולם השנייה. הוא היה אחראי על בידוד חלקיק האלבומין בסרום של פלזמת הדם, שחשוב בשמירה על הלחץ האוסמוטי בכלי הדם. זה היה חיוני לשמירה על החיילים בחיים.

בשנת 1953 פרנסיס קריק, יחד עם רוזלינד פרנקלין וג'יימס ווטסון, קבעו את מבנה ה-DNA, והראו שהוא מורכב משני גדילים של שרשראות ארוכות של נוקלאוטידים של חומצות גרעין. גילוי פורץ דרך זה סלל את הדרך עבור Meselson ו-Stahl, שהצליחו לפתח פרוטוקול צנטריפוגה צפיפות שיפוע לבודד DNA מחיידקי E. Coli כשהם הדגימו שכפול חצי שמרני של DNA במהלך הניסוי שלהם ב-1958.

טכניקות של מיצוי חומצת גרעין

מהם 4 השלבים של מיצוי DNA?
כל שיטות המיצוי מסתכמות באותם שלבים בסיסיים.

שיבוש תאים. שלב זה, המכונה גם תמוגה של תאים, כולל פירוק דופן התא ו/או קרום התא, על מנת לשחרר את הנוזלים התוך-תאיים המכילים את חומצות הגרעין המעניינות.

הסרת פסולת לא רצויה. זה כולל שומני ממברנה, חלבונים וחומצות גרעין לא רצויות אחרות שיכולות להפריע ליישומים במורד הזרם.

בידוד. ישנן מספר דרכים שונות לבודד את חומצות הגרעין המעניינות מהליסאט הפונה שיצרת, אשר נופלות בין שתי קטגוריות עיקריות: מבוסס תמיסה או מצב מוצק (ראה סעיף הבא).

ריכוז. לאחר בידוד של חומצות הגרעין מכל שאר המזהמים והמדללים, הן מוצגות במפלט מרוכז מאוד.

שני סוגי החילוץ
ישנם שני סוגים של מיצוי חומצת גרעין - שיטות מבוססות תמיסות ושיטות מצב מוצק. השיטה מבוססת הפתרונות ידועה גם כשיטת המיצוי הכימי, שכן היא כוללת שימוש בכימיקלים לפירוק התא וגישה לחומר הגרעין. זה יכול להיות שימוש בתרכובות אורגניות כמו פנול וכלורופורם, או בתרכובות אורגניות פחות מזיקות ולכן מומלצות יותר כמו Proteinase K או סיליקה ג'ל.

דוגמאות לשיטות מיצוי כימיות שונות לפירוק תא כוללות:

- קרע אוסמוטי של הממברנה

- עיכול אנזימטי של דופן התא

- ממיסות של ממברנה

- עם חומרי ניקוי

- עם טיפול אלקלי

טכניקות של מצב מוצק, הידועות גם כשיטות מכניות, כוללות ניצול האופן שבו DNA מקיים אינטראקציה עם מצע מוצק. על ידי בחירת חרוז או מולקולה שה-DNA ייקשר אליו אך האנליט לא יקשר, אפשר להפריד בין השניים. דוגמאות לטכניקות מיצוי שלב מוצק כולל שימוש בסיליקה וחרוזים מגנטיים.

הסבר על חילוץ חרוזים מגנטיים

שיטת מיצוי החרוזים המגנטיים
הפוטנציאל לחילוץ באמצעות חרוזים מגנטיים הוכר לראשונה בפטנט אמריקאי שהגיש טרבור הוקינס, עבור מוסד המחקר של מכון ווייטהד. פטנט זה הכיר בכך שניתן לחלץ חומר גנטי על ידי קשירתם לנשא תומך מוצק, שיכול להיות חרוז מגנטי. העיקרון הוא שאתה משתמש בחרוז מגנטי בעל פונקציונליות גבוהה שאליו החומר הגנטי ייקשר, שאותו ניתן להפריד מהסופרנטנט על ידי הפעלת כוח מגנטי על החלק החיצוני של הכלי המחזיק את הדגימה.

למה להשתמש בחילוץ חרוזים מגנטיים?
טכנולוגיית מיצוי החרוזים המגנטיים הופכת נפוצה יותר ויותר, בשל הפוטנציאל הטמון בה להליכי מיצוי מהירים ויעילים. בתקופה האחרונה היו פיתוחים של חרוזים מגנטיים בעלי פונקציונליות גבוהה עם מערכות חיץ מתאימות, אשר אפשרו אוטומציה של מיצוי חומצות גרעין וזרימת עבודה שהיא מאוד קלת משאבים וחסכונית. כמו כן, שיטות מיצוי חרוזים מגנטיים אינן כוללות את שלבי הצנטריפוגה שעלולים לגרום לכוחות גזירה המפרקים חתיכות ארוכות יותר של DNA. המשמעות היא שגדילים ארוכים יותר של DNA נשארים שלמים, וזה חשוב בבדיקות הגנומיות.