כמה תבנית עלינו להוסיף לתגובת ה- PCR שלי?

אף על פי שבתיאוריה, מולקולה אחת של התבנית תספיק, בדרך כלל משתמשים בכמויות גדולות יותר של DNA עבור PCR קלאסי, למשל, עד 1 מיקרוגרם של DNA של יונקים גנומיים ואל פחות PG של DNA פלסמיד. הסכום האופטימלי תלוי במידה רבה במספר העותקים של רצף היעד, כמו גם במורכבותו.

אם משתמשים בתבנית מעט מאוד, יהיה צורך עלייה מקבילה במספר מחזורי ההגברה בכדי להשיג כמות מספקת של מוצר. פולימראז TAQ המשמש לרוב ניסויי ה- PCR אינו כולל פונקציית תיקון (פעילות אקסונוקליז 3′-5 ′); לפיכך, לא ניתן לתקן שגיאות המתרחשות במהלך ההגברה. ככל שמספר המחזורים גבוה יותר, כך תהיה ההגברה של המוצר הפגום יותר. אם לעומת זאת, כמות התבנית גבוהה מדי, ההסתברות לפריימרים לחסל רצפי אחרים (לא מאה אחוז מחמיאים), כמו גם היווצרות דימרים פריימר, תגדל, מה שיביא להגברה של תוצרי לוואי. במקרים רבים, ה- DNA מבודד מתרבויות תאים או ממיקרואורגניזמים ומשמש לאחר מכן כתבנית PCR. לאחר הטיהור, יש לקבוע את ריכוז ה- DNA כדי להיות מסוגל להגדיר את הנפח הנדרש להגדרת ה- PCR. בעוד שאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז עשויה לשמש כדי לספק אומדן, שיטה זו רחוקה מלהיות מדויקת. ספקטרופוטומטריה של UV-Vis הוקמה כתקן הזהב לכימות חומצות גרעין; שיטה ישירה ולכן קלה ומהירה מודדת ספיגה של הדגימה במהירות 260 ננומטר, וריכוז מחושב בעזרת גורם המרה.

אם ריכוז ה- DNA נמוך מאוד, עם זאת (<1 מיקרוגרם/מ"ל dSDNA), או אם הוא מזוהם בחומרים הסופגים גם בטווח של 260 ננומטר (למשל RNA, חלבון, מלחים), שיטה זו תגיע למגבלותיו. במקרה של ריכוזים נמוכים מאוד, הקריאות בקרוב יהפכו לא מדויקות מכדי שישתמשו בהן, וזיהומים יובילו להערכת יתר (לעיתים עצומה) של הערך בפועל. במקרה זה, כימות באמצעות פלואורסצנט עשוי להוות אלטרנטיבה. טכניקה זו מבוססת על שימוש בצבע ניאון הנקשר באופן ספציפי ל- dsDNA רק המתחם הכולל חומצה גרעינית וצבע מתרגש מהאור, והוא יפלט אור לאחר מכן באורך גל גבוה מעט יותר. כאן, עוצמת האות הפלואורסצנטי פרופורציונלית לכמות ה- DNA, ולקביעת הריכוז היא מוערכת ביחס לעקומה סטנדרטית. היתרונות של שיטה זו נשענים על הספציפיות של הקשר, המוציאה את ההשפעות החיצוניות שהוצגו על ידי זיהום, כמו גם על היכולת המתקבלת לאתר ריכוזים נמוכים מאוד של DNA. ההתאמה של אחת מהשיטות תלויה בעיקר בריכוז הדגימה ובטהרה; במקרים רבים עשוי אפילו להיות מומלץ ליישם את שתי השיטות במקביל.