Affinché le reazioni di amplificazione abbiano successo, è necessario che i singoli componenti della reazione siano presenti nella concentrazione corretta in ciascuna preparazione. Inoltre, è importante che non si verifichi alcuna contaminazione.
Soprattutto quando è necessario impostare molte reazioni, è stato deciso di preparare una cosiddetta master mix invece di pipettare ciascun reagente separatamente in ciascun recipiente. Sono disponibili in commercio miscele preconfigurate in cui vengono aggiunti solo i componenti specifici del campione (primer) e acqua. In alternativa, la master mix può essere preparata da soli. In entrambe le varianti la miscela viene distribuita in ogni recipiente PCR senza templato e alla fine il singolo campione di DNA viene aggiunto separatamente.
L'utilizzo di una master mix presenta numerosi vantaggi: in primo luogo, viene ridotto il numero di singole fasi di pipettaggio. In questo modo, sia il rischio di errori da parte dell'utente durante il pipettaggio sia il rischio di contaminazione sono ridotti al minimo e, naturalmente, si risparmia tempo. In linea di principio anche la precisione di pipettaggio è maggiore poiché vengono dosati volumi maggiori. Questo è facile da capire quando si controllano i dati tecnici delle pipette: quanto più piccolo è il volume dosato, tanto maggiori possono essere le deviazioni. Il fatto che tutti i preparati provengano dallo stesso recipiente ha un effetto positivo sull'omogeneità (se ben miscelati). Ciò migliora anche la riproducibilità degli esperimenti.
Durante la preparazione della master mix è necessario aggiungere almeno il 10% di volume in più (ad es. se sono necessarie 10 preparazioni, calcolare sulla base di 11), in modo che anche l'ultimo recipiente si riempia correttamente. In questo modo è possibile compensare (leggere) imprecisioni nel pipettaggio e l'effetto della perdita di campione durante il dosaggio di soluzioni contenenti detergente. I detergenti sono contenuti in soluzioni enzimatiche come polimerasi e master mix, causando la formazione di schiuma e residui sulla superficie interna dei normalipuntali per pipette.
A seconda dell'applicazione e del tipo di liquido da dispensare, è necessario scegliere la tecnica di pipettaggio corretta (1) e selezionare l'attrezzatura adeguata. Per le soluzioni contenenti detergenti, si consiglia un sistema a spostamento diretto o i cosiddetti puntali per pipette a “bassa ritenzione” come alternativa alle pipette a cuscino d'aria. L'effetto diPunta ACE PIPETTAsi basa su una superficie particolarmente idrofobica. I liquidi contenenti detersivi non lasciano una pellicola residua all'interno e all'esterno, in modo che la perdita di soluzione possa essere ridotta al minimo.
Oltre al dosaggio esatto di tutti i componenti, è anche importante che non si verifichi alcuna contaminazione dei preparati. Non è sufficiente utilizzare materiali di consumo ad elevata purezza, poiché il processo di pipettaggio in una pipetta a cuscino d'aria può produrre aerosol che rimangono nella pipetta. Il DNA eventualmente contenuto nell'aerosol può essere trasferito da un campione a quello successivo nella successiva fase di pipettaggio e provocare quindi una contaminazione. Anche i sistemi a spostamento diretto sopra menzionati possono minimizzare questo rischio. Per le pipette a cuscino d'aria è opportuno utilizzare puntali con filtro per proteggere il cono della pipetta trattenendo spruzzi, aerosol e biomolecole.
Orario di pubblicazione: 06-dic-2022