Per reazioni di amplificazione riuscite, è necessario che i singoli componenti di reazione siano presenti nella concentrazione corretta in ciascuna preparazione. Inoltre, è importante che non si verifichi contaminazione.
Soprattutto quando è necessario impostare molte reazioni, è stato stabilito per preparare un cosiddetto mix master invece di pipettare ciascun reagente separatamente in ogni nave. Le miscele preconfigurate sono disponibili in commercio, in cui vengono aggiunti solo componenti specifici del campione (primer) e acqua. In alternativa, il master mix può essere preparato da solo. In entrambe le varianti, la miscela viene distribuita a ciascun recipiente PCR senza modello e il singolo campione di DNA viene aggiunto separatamente alla fine.
L'uso di un mix master ha diversi vantaggi: in primo luogo, il numero di singoli passaggi di pipa è ridotto. In questo modo, sia il rischio di errori dell'utente durante la pipettatura che il rischio di contaminazione sono ridotti al minimo e, ovviamente, il tempo viene risparmiato. In linea di principio, anche l'accuratezza della pipa è più elevata, poiché vengono dosati volumi più grandi. Questo è facile da capire quando si controllano i dati tecnici delle pipette: più piccolo è il volume dose, più elevate possono essere le deviazioni. Il fatto che tutti i preparativi provengano dalla stessa nave abbia un effetto positivo sull'omogeneità (se ben miscelato). Ciò migliora anche la riproducibilità degli esperimenti.
Quando si prepara il mix principale, è necessario aggiungere almeno il 10 % di volume extra (ad esempio se sono necessari 10 preparativi, calcolare sulla base di 11), in modo che persino l'ultima nave riempiva correttamente. In questo modo, (lievi) inesattezze di pipettazioni e l'effetto della perdita del campione quando si possono compensare le soluzioni contenenti detergenti. I detergenti sono contenuti in soluzioni enzimatiche come polimerasi e miscele master, causando formazione di schiuma e residui sulla superficie interna della normaleSuggerimenti per pipette.
A seconda dell'applicazione e del tipo di liquido da distribuire, è necessario scegliere la tecnica di pipettatura corretta (1) e l'apparecchiatura appropriata selezionata. Per soluzioni contenenti detergenti, si raccomandano un sistema di spostamento diretto o le cosiddette punte di pipetta "a bassa ritenzione" in alternativa per le pipette ad aria-aria. L'effetto diSuggerimento per pipetta Acesi basa su una superficie particolarmente idrofobica. I liquidi contenenti detergenti non lasciano un film di residui all'interno e all'esterno, in modo che la perdita di soluzione possa essere ridotta al minimo.
Oltre al dosaggio esatto di tutti i componenti, è anche importante che non si verifichi alcuna contaminazione dei preparazioni. Non è sufficiente utilizzare materiali di consumo ad alta purezza, poiché il processo di pipettatura in una pipetta ad aria può produrre aerosol che rimangono nella pipetta. Il DNA che può essere contenuto nell'aerosol può essere trasferito da un campione all'altro nella fase di pipettatura seguente e quindi portare a contaminazione. I sistemi di spostamento diretto sopra menzionati possono anche ridurre al minimo questo rischio. Per le pipette a manutenzione ad aria ha senso utilizzare le punte del filtro per proteggere il cono della pipetta mantenendo schizzi, aerosol e biomolecole.
Tempo post: DEC-06-2022