Criovialisono comunemente usati per lo stoccaggio criogenico di linee cellulari e altri materiali biologici critici, in dewar riempiti di azoto liquido.

Esistono diverse fasi coinvolte nella riuscita conservazione delle cellule nell'azoto liquido. Sebbene il principio di base sia il congelamento lento, la tecnica esatta impiegata dipende dal tipo di cellula e dal crioprotettore utilizzato. Esistono diverse considerazioni sulla sicurezza e migliori pratiche da tenere in considerazione quando si conservano le celle a temperature così basse.

Questo post ha lo scopo di fornire una panoramica di come le crioviali vengono conservate nell'azoto liquido.

Cosa sono i Cryovials

I Cryovials sono piccole fiale con tappo progettate per la conservazione di campioni liquidi a temperature estremamente basse. Garantiscono che le cellule conservate nel crioprotettore non entrino in contatto diretto con l'azoto liquido, riducendo al minimo il rischio di fratture cellulari pur beneficiando dell'estremo effetto rinfrescante dell'azoto liquido.

Le fiale sono generalmente disponibili in una gamma di volumi e design: possono essere filettate internamente o esternamente con fondo piatto o arrotondato. Sono disponibili anche formati sterili e non sterili.

Chi utilizzaCirovialiper conservare le cellule nell'azoto liquido

Una serie di laboratori privati ​​e del servizio sanitario nazionale, nonché istituti di ricerca specializzati nella conservazione del sangue cordonale, nella biologia delle cellule epiteliali, nell'immunologia e nella biologia delle cellule staminali utilizzano crioviali per crioconservare le cellule.

Le cellule conservate in questo modo includono cellule B e T, cellule CHO, cellule staminali emopoietiche e cellule progenitrici, ibridomi, cellule intestinali, macrofagi, cellule staminali mesenchimali e cellule progenitrici, monociti, mieloma, cellule NK e cellule staminali pluripotenti.

Panoramica su come conservare i Cryovials nell'azoto liquido

La crioconservazione è un processo che preserva le cellule e altri costrutti biologici raffreddandoli a temperature molto basse. Le cellule possono essere conservate in azoto liquido per anni senza perdita di vitalità cellulare. Questo è uno schema delle procedure impiegate.

Preparazione delle cellule

Il metodo esatto per preparare i campioni varia a seconda del tipo di cellula, ma in generale le cellule vengono raccolte e centrifugate per sviluppare un pellet ricco di cellule. Questo pellet viene quindi risospeso nel surnatante miscelato con crioprotettore o con un mezzo di crioconservazione.

Mezzo di crioconservazione

Questo terreno viene utilizzato per preservare le cellule negli ambienti a bassa temperatura a cui saranno sottoposte inibendo la formazione di cristalli intra ed extracellulari e quindi la morte cellulare. Il loro ruolo è quello di fornire un ambiente sicuro e protettivo per cellule e tessuti durante i processi di congelamento, conservazione e scongelamento.

Un mezzo come plasma fresco congelato (FFP), soluzione di plasmalita eparinizzato o soluzioni prive di siero e prive di componenti animali viene miscelato con crioprotettori come dimetilsolfossido (DMSO) o glicerolo.

Il pellet di campione riliquidato viene suddiviso in aliquote in crioviali di polipropilene comeFiale per conservazione criogenica della società Suzhou Ace Biomedical.

È importante non riempire eccessivamente le crioviale poiché ciò aumenterebbe il rischio di rotture e il possibile rilascio del contenuto (1).

Velocità di congelamento controllata

In generale, per la riuscita della crioconservazione delle cellule viene impiegata una velocità di congelamento lenta e controllata.

Dopo che i campioni sono stati aliquotati in fiale criogeniche, vengono posti su ghiaccio umido o in un frigorifero a 4°C e la procedura di congelamento viene avviata entro 5 minuti. Come guida generale, le celle vengono raffreddate a una velocità compresa tra -1 e -3 al minuto (2). Ciò si ottiene utilizzando un frigorifero programmabile o posizionando le fiale in una scatola isolata posta in un congelatore a velocità controllata da –70°C a –90°C.

Trasferimento in azoto liquido

Le fiale criogeniche congelate vengono quindi trasferite in un serbatoio di azoto liquido per periodi indefiniti a condizione che venga mantenuta una temperatura inferiore a -135 ℃.

Queste temperature ultrabasse possono essere ottenute mediante immersione nell'azoto in fase liquida o vapore.

Fase liquida o vapore?

È noto che lo stoccaggio in azoto in fase liquida mantiene la temperatura fredda con assoluta coerenza, ma spesso non è consigliato per i seguenti motivi:

• La necessità di grandi volumi (profondità) di azoto liquido che rappresenta un potenziale pericolo. Ustioni o asfissia a causa di ciò rappresentano un rischio reale.
• Casi documentati di contaminazione crociata da parte di agenti infettivi come aspergillus, epatite B e diffusione virale attraverso il mezzo di azoto liquido (2,3)
• La possibilità che l'azoto liquido fuoriesca nelle fiale durante l'immersione. Quando viene rimosso dallo stoccaggio e riscaldato a temperatura ambiente, l'azoto si espande rapidamente. Di conseguenza, la fiala potrebbe frantumarsi quando viene rimossa dal deposito di azoto liquido, creando un pericolo sia dovuto ai detriti volanti che all'esposizione al contenuto (1, 4).

Per questi motivi, lo stoccaggio a temperature ultra-basse avviene più comunemente in azoto in fase vapore. Quando i campioni devono essere conservati in fase liquida, è necessario utilizzare tubi cryoflex specializzati.

Lo svantaggio della fase vapore è che può verificarsi un gradiente di temperatura verticale con conseguenti fluttuazioni di temperatura tra -135 ℃ e -190 ℃. Ciò richiede un monitoraggio attento e diligente dei livelli di azoto liquido e delle variazioni di temperatura (5).

Molti produttori consigliano che le crioviali siano adatte per la conservazione fino a -135℃ o per l'uso solo in fase vapore.

Scongelamento delle cellule crioconservate

La procedura di scongelamento è stressante per una coltura congelata e sono necessarie una manipolazione e una tecnica adeguate per garantire vitalità, recupero e funzionalità ottimali delle cellule. Gli esatti protocolli di scongelamento dipenderanno dai tipi cellulari specifici. Tuttavia, lo scongelamento rapido è considerato standard per:

• Diminuire qualsiasi impatto sul recupero cellulare
• Aiuta a ridurre il tempo di esposizione ai soluti presenti nei mezzi di congelamento
• Ridurre al minimo eventuali danni dovuti alla ricristallizzazione del ghiaccio

Per scongelare i campioni vengono comunemente utilizzati bagnimaria, bagni di perline o strumenti automatizzati specializzati.

Nella maggior parte dei casi viene scongelata 1 linea cellulare alla volta per 1-2 minuti, agitando delicatamente in un bagno d'acqua a 37 ℃ fino a quando nella fiala rimane solo un po' di ghiaccio prima di lavarla in un terreno di crescita preriscaldato.

Per alcune cellule, come gli embrioni dei mammiferi, il riscaldamento lento è essenziale per la loro sopravvivenza.

Le cellule sono ora pronte per la coltura cellulare, l'isolamento cellulare o, nel caso delle cellule staminali emopoietiche, studi di vitalità per garantire l'integrità delle cellule staminali del donatore prima della terapia mieloablativa.

È prassi normale prelevare piccole aliquote del campione prelavato utilizzato per eseguire un conteggio cellulare per determinare le concentrazioni cellulari per la piastratura in coltura. È quindi possibile valutare i risultati delle procedure di isolamento delle cellule e determinare la vitalità cellulare.

Migliori pratiche per la conservazione dei Cryovials

Il successo della crioconservazione dei campioni conservati nelle crioviali dipende da molti elementi del protocollo, tra cui la corretta conservazione e la tenuta dei registri.

• Dividi le celle tra posizioni di archiviazione– Se i volumi lo consentono, dividere le cellule tra fiale e conservarle in luoghi separati per ridurre il rischio di perdita di campione a causa di guasti alle apparecchiature.
• Prevenire la contaminazione incrociata– Optare per fiale criogeniche sterili monouso o per autoclavarle prima dell’uso successivo
• Utilizza fiale di dimensioni adeguate per le tue cellule– Le fiale sono disponibili in una gamma di volumi compresa tra 1 e 5 ml. Evitare di riempire eccessivamente le fiale per ridurre il rischio di rotture.
• Selezionare fiale criogeniche con filettatura interna o esterna– Alcune università raccomandano fiale con filettatura interna come misure di sicurezza; possono anche prevenire la contaminazione durante il riempimento o quando vengono conservate nell'azoto liquido.
• Prevenire le perdite- Utilizzare guarnizioni a doppia iniezione stampate nel tappo a vite o negli O-ring per evitare perdite e contaminazione.
• Utilizza codici a barre 2D ed etichetta le fiale– per garantire la tracciabilità, i flaconi con ampie aree di scrittura consentono di etichettare adeguatamente ciascun flacone. I codici a barre 2D possono aiutare nella gestione dell'archiviazione e nella tenuta dei registri. I cappucci codificati a colori sono utili per una più facile identificazione.
• Adeguata manutenzione dello stoccaggio- Per garantire che le cellule non vadano perse, i contenitori di stoccaggio dovrebbero monitorare costantemente la temperatura e i livelli di azoto liquido. Dovrebbero essere installati allarmi per avvisare gli utenti degli errori.

Precauzioni di sicurezza

L’azoto liquido è diventato una pratica comune nella ricerca moderna, ma comporta il rischio di gravi lesioni se utilizzato in modo errato.

È necessario indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) adeguati per ridurre al minimo il rischio di congelamento, ustioni e altri incidenti avversi durante la manipolazione dell'azoto liquido. Indossare

• Guanti criogenici
• Camice da laboratorio
• Visiera integrale resistente agli urti che copre anche il collo
• Scarpe a punta chiusa
• Grembiule in plastica antispruzzo

I frigoriferi ad azoto liquido devono essere collocati in aree ben ventilate per ridurre al minimo il rischio di asfissia: l'azoto fuoriuscito vaporizza e sostituisce l'ossigeno atmosferico. I negozi di grandi volumi dovrebbero avere sistemi di allarme per il basso livello di ossigeno.

Lavorare in coppia quando si maneggia l'azoto liquido è l'ideale e il suo utilizzo al di fuori del normale orario di lavoro dovrebbe essere vietato.

Cryovials per supportare il tuo flusso di lavoro

L'azienda Suzhou Ace Biomedical offre un'ampia selezione di prodotti che soddisfano le vostre esigenze di crioconservazione per diversi tipi di cellule. Il portafoglio comprende una gamma di provette e una gamma di criovial sterili.

Le nostre crioviali sono:

• Laboratorio con tappo a vite 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml Cryovial Fiale criogeniche Criotubo a fondo conico con guarnizione

  ● Specifiche da 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, con o senza gonna
  ● Sono disponibili entrambi i modelli conici o autoportanti, sterili o non sterili
  ● Le provette con tappo a vite sono realizzate in polipropilene di grado medico
  ● Le fiale PP Cryotube possono essere congelate e scongelate ripetutamente
  ●Il design del cappuccio esterno può ridurre la probabilità di contaminazione durante il trattamento del campione.
  ● Tubi criogenici con tappo a vite Filettature universali per l'uso
  ● I tubi si adattano ai rotori più comuni
  ● I tubi con o-ring per tubi criogenici si adattano a contenitori congelatori standard da 1 pollice e 2 pollici, 48 pozzetti, 81 pozzetti, 96 pozzetti e 100 pozzetti
  ● Autoclavabile a 121°C e congelabile a -86°C

  PARTE N	MATERIALE	VOLUME	CAPCOLORE	PZ/BORSA	BORSE/VALIGIE
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Nero, giallo, blu, rosso, viola, bianco	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Nero, giallo, blu, rosso, viola, bianco	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Nero, giallo, blu, rosso, viola, bianco	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Nero, giallo, blu, rosso, viola, bianco	500	10