La standardizzazione dei processi comprende la loro ottimizzazione e la successiva definizione e armonizzazione, consentendo prestazioni ottimali a lungo termine, indipendentemente dall'utente. La standardizzazione garantisce risultati di alta qualità, nonché la loro riproducibilità e comparabilità.
L'obiettivo della PCR (classica) è la generazione di un risultato affidabile e riproducibile. Per alcune applicazioni, la resa delProdotto PCRè anche rilevante. Per queste reazioni è necessario prestare attenzione per garantire che i campioni non siano compromessi e che il flusso di lavoro della PCR rimanga stabile. Nello specifico, ciò si traduce nel ridurre al minimo l'introduzione di contaminazioni che potrebbero portare a risultati falsi positivi o falsi negativi o addirittura inibire la reazione PCR. Inoltre, le condizioni di reazione dovrebbero essere quanto più identiche possibile per ogni singolo campione all'interno di un ciclo ed essere trasferibili anche a reazioni successive (dello stesso metodo). Ciò si riferisce alla composizione delle reazioni e al tipo di controllo della temperatura nel termociclatore. Naturalmente gli errori degli utenti devono essere evitati il più possibile.
Di seguito, dimostreremo le sfide che si incontrano durante la preparazione e durante l'esecuzione di una PCR e gli approcci alle soluzioni esistenti rispetto agli strumenti e ai materiali di consumo utilizzati per la standardizzazione dei flussi di lavoro della PCR.
Preparazione della reazione
La dispensazione dei componenti di reazione rispettivamente nei recipienti per PCR o nelle piastre comporta molteplici sfide che devono essere superate:
Condizioni di reazione
Il dosaggio esatto e preciso dei singoli componenti è indispensabile quando si mira a condizioni di reazione quanto più identiche possibili. Oltre a una buona tecnica di pipettaggio, la scelta dello strumento giusto è fondamentale. Le master mix PCR contengono spesso sostanze che aumentano la viscosità o generano schiuma. Durante il processo di pipettaggio, questi portano ad una notevole bagnatura delpuntali per pipette, riducendo così la precisione del pipettaggio. L'uso di sistemi di dispensazione diretta o di puntali per pipette alternativi meno soggetti a bagnarsi può migliorare l'accuratezza e la precisione del processo di pipettaggio.
Contaminazioni
Durante il processo di dispensazione vengono generati aerosol che, se raggiungono l'interno della pipetta, possono potenzialmente contaminare un altro campione durante la fase di pipettaggio successiva. Ciò può essere evitato utilizzando puntali con filtro o sistemi a spostamento diretto.
Materiali di consumo comesuggerimenti, i recipienti e le piastre utilizzati nel flusso di lavoro della PCR non devono contenere sostanze che compromettano il campione o falsifichino il risultato. Questi includono DNA, DNasi, RNasi e inibitori della PCR, nonché componenti che potrebbero potenzialmente fuoriuscire dal materiale durante la reazione: sostanze note come sostanze rilasciabili.
Errore dell'utente
Più campioni vengono elaborati, maggiore è il rischio di errore. Può facilmente accadere che un campione venga pipettato nel recipiente o nel pozzetto sbagliato. Questo rischio può essere notevolmente ridotto mediante una marcatura facilmente riconoscibile dei pozzetti. Attraverso l'automazione delle fasi di dispensazione, il "fattore umano", ovvero gli errori e le variazioni legate all'utente, vengono ridotti al minimo, aumentando così la riproducibilità, soprattutto nel caso di piccoli volumi di reazione. Ciò richiede piastre di sufficiente stabilità dimensionale per essere impiegate in una stazione di lavoro. I codici a barre allegati garantiscono un'ulteriore leggibilità automatica, che semplifica il monitoraggio dei campioni durante l'intero processo.
Programmazione del termociclatore
La programmazione di uno strumento può rivelarsi dispendiosa in termini di tempo e soggetta a errori. Diverse funzionalità del termociclatore PCR lavorano insieme per semplificare questa fase del processo e, soprattutto, per renderla sicura:
Il funzionamento semplice e una buona guida per l'utente sono la base di una programmazione efficiente. Basandosi su questa base, l'amministrazione utenti protetta da password impedirà che i propri programmi vengano modificati da altri utenti. Se si utilizzano più termociclatori (dello stesso tipo), è utile se un programma può essere trasferito direttamente da uno strumento a un altro tramite USB o connettività. Il software per computer consente l'amministrazione centralizzata e sicura di programmi, diritti utente e documenti su un computer.
Esecuzione della PCR
Durante la corsa, il DNA viene amplificato nel recipiente di reazione, dove ciascun campione deve essere sottoposto a condizioni di reazione identiche e coerenti. I seguenti aspetti sono rilevanti per il processo:
Controllo della temperatura
L'eccellente precisione nel controllo della temperatura e l'omogeneità del blocco termociclatore sono la base per un condizionamento uniforme della temperatura di tutti i campioni. L’elevata qualità degli elementi riscaldanti e raffreddanti (elementi Peltier), nonché il modo in cui questi sono collegati al blocco, sono i fattori decisivi che determineranno il rischio di discrepanze di temperatura note come “effetto bordo”
Evaporazione
Le concentrazioni dei singoli componenti della reazione non dovrebbero cambiare nel corso della reazione a causa dell'evaporazione. Altrimenti è possibile che molto pocoProdotto PCRpossono essere generati o non essere generati affatto. È quindi fondamentale ridurre al minimo l'evaporazione garantendo una tenuta sicura. In questo caso, il coperchio riscaldato del termociclatore e la guarnizione del recipiente lavorano mano nella mano. Sono disponibili diverse opzioni di sigillaturaPiastre PCR (link: Articolo sulla sigillatura), per cui la migliore tenuta si ottiene mediante termosaldatura. Possono essere adatte anche altre chiusure, purché la pressione di contatto del coperchio del termociclatore possa essere adattata alla guarnizione selezionata.
È in atto la standardizzazione dei processi al fine di salvaguardare risultati accurati e riproducibili a lungo termine. Ciò include la manutenzione regolare dell'attrezzatura per garantire che sia sempre in buone condizioni di funzionamento. Tutti i materiali di consumo devono essere di qualità costantemente elevata in tutti i lotti prodotti e la loro disponibilità affidabile deve essere garantita.
Orario di pubblicazione: 29 novembre 2022