Introduzione
Cos'è l'estrazione di acido nucleico?
In termini più semplici, l'estrazione dell'acido nucleico è la rimozione dell'RNA e/o del DNA da un campione e tutto l'eccesso che non è necessario. Il processo di estrazione isola gli acidi nucleici da un campione e li produce sotto forma di un eluato concentrato, libero da diluenti e contaminanti che potrebbero influire su eventuali applicazioni a valle.
Applicazioni dell'estrazione di acido nucleico
Gli acidi nucleici purificati vengono utilizzati in una pletora di diverse applicazioni, che vanno in più settori diversi. L'assistenza sanitaria è forse l'area in cui viene utilizzata di più, con RNA e DNA purificati richiesti per una serie di diversi scopi di test.
Le applicazioni dell'estrazione di acido nucleico nell'assistenza sanitaria includono:
- Sequenziamento di prossima generazione (NGS)
- genotipizzazione SNP basata sull'amplificazione
- genotipizzazione basata su array
- Digestione degli enzimi di restrizione
- Analisi mediante enzimi modificanti (ad es. Legatura e clonazione)
Esistono anche altri campi oltre l'assistenza sanitaria in cui viene utilizzata l'estrazione dell'acido nucleico, incluso ma non limitato ai test di paternità, alla forense e alla genomica.
Una breve storia di estrazione di acido nucleico
Estrazione del DNArisale a lungo, con il primo isolamento noto che è stato eseguito da un medico svizzero di nome Friedrich Miescher nel 1869. Miescher sperava di risolvere i principi fondamentali della vita determinando la composizione chimica delle cellule. Dopo aver fallito con i linfociti, è stato in grado di ottenere un precipitato grezzo di DNA dai leucociti trovati in pus su bende scartate. Lo ha fatto aggiungendo acido e poi alcali alla cellula per lasciare il citoplasma della cellula e quindi ha sviluppato un protocollo per separare il DNA dalle altre proteine.
Seguendo la ricerca innovativa di Miescher, molti altri scienziati hanno continuato a far avanzare e sviluppare tecniche per isolare e purificare il DNA. Edwin Joseph Cohn, uno scienziato proteico, ha sviluppato molte tecniche per la purificazione delle proteine durante la seconda guerra mondiale. Era responsabile dell'isolamento della frazione sierica di albumina del plasma sanguigno, che è importante per mantenere la pressione osmotica nei vasi sanguigni. Questo è stato cruciale per mantenere in vita i soldati.
Nel 1953 Francis Crick, insieme a Rosalind Franklin e James Watson, determinò la struttura del DNA, dimostrando che era costituita da due fili di lunghe catene di nucleotidi di acido nucleico. Questa scoperta innovativa ha spianato la strada a Meselson e Stahl, che sono stati in grado di sviluppare un protocollo di centrifugazione a gradiente di densità per isolare il DNA dai batteri E. coli mentre hanno dimostrato la replicazione semicarservatrice del DNA durante il loro esperimento del 1958.
Tecniche di estrazione di acido nucleico
Quali sono le 4 fasi dell'estrazione del DNA?
Tutti i metodi di estrazione si riducono agli stessi passaggi fondamentali.
Interruzione cellulare. Questa fase, nota anche come lisi cellulare, prevede la scomparsa della parete cellulare e/o della membrana cellulare, per rilasciare i fluidi intra-cellulari contenenti gli acidi nucleici di interesse.
Rimozione di detriti indesiderati. Ciò include lipidi di membrana, proteine e altri acidi nucleici indesiderati che possono interferire con le applicazioni a valle.
Isolamento. Esistono diversi modi per isolare gli acidi nucleici di interesse dal lisato cancellato che hai creato, che rientrano tra due categorie principali: basato sulla soluzione o stato solido (vedi sezione successiva).
Concentrazione. Dopo che gli acidi nucleici sono stati isolati da tutti gli altri contaminanti e diluenti, sono presentati in un eluato altamente concentrato.
I due tipi di estrazione
Esistono due tipi di estrazione di acido nucleico: metodi basati sulla soluzione e metodi a stato solido. Il metodo basato sulla soluzione è anche noto come metodo di estrazione chimica, in quanto comporta l'uso di sostanze chimiche per abbattere la cellula e accedere al materiale nucleico. Questo può utilizzare composti organici come fenolo e cloroformio, o i composti inorganici meno dannosi e quindi più raccomandati come la proteinasi K o il gel di silice.
Esempi di diversi metodi di estrazione chimica per abbattere una cellula includono:
- Rottura osmotica della membrana
- Digestione enzimatica della parete cellulare
- solubilizzazione della membrana
- con detergenti
- Con il trattamento alcali
Le tecniche a stato solido, note anche come metodi meccanici, prevedono lo sfruttamento di come il DNA interagisce con un substrato solido. Selezionando un tallone o una molecola su cui il DNA si legarà ma l'analita non farà, è possibile separare i due. Esempi di tecniche di estrazione in fase solida tra cui l'uso di perle di silice e magnetiche.
Estrazione di perline magnetica spiegata
Il metodo di estrazione del tallone magnetico
Il potenziale di estrazione usando perle magnetiche è stato riconosciuto per la prima volta in un brevetto statunitense presentato da Trevor Hawkins, per il Whitehead Institute Research Institution. Questo brevetto ha riconosciuto che era possibile estrarre materiale genetico legandoli a un solido portatore di supporto, che potrebbe essere un tallone magnetico. Il principio è che si utilizza un tallone magnetico altamente funzionalizzato su cui si lega il materiale genetico, che può quindi essere separato dal surnatante applicando una forza magnetica all'esterno della nave che tiene il campione.
Perché usare l'estrazione di perline magnetiche?
La tecnologia di estrazione del tallone magnetico sta diventando sempre più diffusa, a causa del potenziale che detiene per procedure di estrazione rapide ed efficienti. In tempi recenti ci sono stati sviluppi di perle magnetiche altamente funzionalizzate con sistemi di tampone adeguati, che hanno reso possibile l'automazione dell'estrazione di acido nucleico e un flusso di lavoro che è una luce molto risorsa ed efficiente in termini di costi. Inoltre, i metodi di estrazione del tallone magnetico non coinvolgono le fasi di centrifugazione che possono causare forze di taglio che rompono pezzi di DNA più lunghi. Ciò significa che i fili più lunghi di DNA rimangono intatti, il che è importante nei test di genomica.
Tempo post: novembre-25-2022