Introduzione
Cos'è l'estrazione dell'acido nucleico?
In termini molto semplici, l'estrazione dell'acido nucleico è la rimozione dell'RNA e/o del DNA da un campione e di tutto l'eccesso non necessario. Il processo di estrazione isola gli acidi nucleici da un campione e li produce sotto forma di eluato concentrato, privo di diluenti e contaminanti che potrebbero influenzare eventuali applicazioni a valle.
Applicazioni dell'estrazione degli acidi nucleici
Gli acidi nucleici purificati sono utilizzati in una miriade di applicazioni diverse, che spaziano in molteplici settori diversi. L'assistenza sanitaria è forse l'area in cui viene utilizzata maggiormente, poiché l'RNA e il DNA purificati sono necessari per una serie di scopi di test diversi.
Le applicazioni dell'estrazione degli acidi nucleici nel settore sanitario includono:
- Sequenziamento di prossima generazione (NGS)
- Genotipizzazione SNP basata sull'amplificazione
- Genotipizzazione basata su array
- Digestione degli enzimi di restrizione
- Analisi utilizzando enzimi modificanti (ad esempio legatura e clonazione)
Esistono anche altri campi oltre all'assistenza sanitaria in cui viene utilizzata l'estrazione dell'acido nucleico, inclusi ma non limitati a test di paternità, medicina legale e genomica.
Una breve storia dell'estrazione dell'acido nucleico
Estrazione del DNArisale a molto tempo fa, il primo isolamento conosciuto fu eseguito da un medico svizzero di nome Friedrich Miescher nel 1869. Miescher sperava di risolvere i principi fondamentali della vita determinando la composizione chimica delle cellule. Dopo aver fallito con i linfociti, è riuscito a ottenere un precipitato grezzo di DNA dai leucociti trovati nel pus sulle bende scartate. Lo ha fatto aggiungendo acido e poi alcali alla cellula per lasciare il citoplasma della cellula, e poi ha sviluppato un protocollo per separare il DNA dalle altre proteine.
Dopo la ricerca innovativa di Miescher, molti altri scienziati hanno continuato a far avanzare e sviluppare tecniche per isolare e purificare il DNA. Edwin Joseph Cohn, uno scienziato delle proteine, sviluppò molte tecniche per la purificazione delle proteine durante la seconda guerra mondiale. È stato responsabile dell'isolamento della frazione sierica dell'albumina del plasma sanguigno, che è importante per mantenere la pressione osmotica nei vasi sanguigni. Questo era fondamentale per mantenere in vita i soldati.
Nel 1953 Francis Crick, insieme a Rosalind Franklin e James Watson, determinò la struttura del DNA, dimostrando che era costituito da due filamenti di lunghe catene di nucleotidi di acidi nucleici. Questa scoperta rivoluzionaria aprì la strada a Meselson e Stahl, che furono in grado di sviluppare un protocollo di centrifugazione in gradiente di densità per isolare il DNA dai batteri E. Coli mentre dimostravano la replicazione semi-conservativa del DNA durante il loro esperimento del 1958.
Tecniche di estrazione degli acidi nucleici
Quali sono le 4 fasi dell'estrazione del DNA?
Tutti i metodi di estrazione si riducono agli stessi passaggi fondamentali.
Distruzione cellulare. Questa fase, nota anche come lisi cellulare, comporta la rottura della parete cellulare e/o della membrana cellulare, per rilasciare i fluidi intracellulari contenenti gli acidi nucleici di interesse.
Rimozione di detriti indesiderati. Ciò include lipidi di membrana, proteine e altri acidi nucleici indesiderati che possono interferire con le applicazioni a valle.
Isolamento. Esistono diversi modi per isolare gli acidi nucleici di interesse dal lisato purificato creato, che rientrano in due categorie principali: a base di soluzione o allo stato solido (vedere la sezione successiva).
Concentrazione. Dopo che gli acidi nucleici sono stati isolati da tutti gli altri contaminanti e diluenti, vengono presentati in un eluato altamente concentrato.
I due tipi di estrazione
Esistono due tipi di estrazione dell'acido nucleico: metodi basati su soluzioni e metodi allo stato solido. Il metodo basato sulla soluzione è noto anche come metodo di estrazione chimica, poiché prevede l'uso di sostanze chimiche per scomporre la cellula e accedere al materiale nucleico. Questo può avvenire utilizzando composti organici come fenolo e cloroformio, oppure composti inorganici meno dannosi e quindi più consigliati come la proteinasi K o il gel di silice.
Esempi di diversi metodi di estrazione chimica per scomporre una cellula includono:
- Rottura osmotica della membrana
- Digestione enzimatica della parete cellulare
- Solubilizzazione della membrana
- Con detersivi
- Con trattamento alcalino
Le tecniche allo stato solido, note anche come metodi meccanici, implicano lo sfruttamento del modo in cui il DNA interagisce con un substrato solido. Selezionando una perla o una molecola a cui si legherà il DNA ma non l'analita, è possibile separare i due. Esempi di tecniche di estrazione in fase solida che includono l'uso di silice e sfere magnetiche.
Spiegazione dell'estrazione delle sfere magnetiche
Il metodo di estrazione delle sfere magnetiche
Il potenziale dell'estrazione mediante biglie magnetiche è stato riconosciuto per la prima volta in un brevetto statunitense depositato da Trevor Hawkins, per l'istituto di ricerca Whitehead Institute. Questo brevetto riconosceva che era possibile estrarre materiale genetico legandolo a un supporto solido, che poteva essere una biglia magnetica. Il principio è che si utilizza una biglia magnetica altamente funzionalizzata alla quale si legherà il materiale genetico, che potrà poi essere separato dal surnatante applicando una forza magnetica all'esterno del recipiente contenente il campione.
Perché utilizzare l'estrazione delle sfere magnetiche?
La tecnologia di estrazione delle sfere magnetiche sta diventando sempre più diffusa, grazie al potenziale che offre per procedure di estrazione rapide ed efficienti. Negli ultimi tempi ci sono stati sviluppi di sfere magnetiche altamente funzionalizzate con sistemi tampone adeguati, che hanno reso possibile l'automazione dell'estrazione dell'acido nucleico e un flusso di lavoro che è molto leggero in termini di risorse ed efficiente in termini di costi. Inoltre, i metodi di estrazione delle sfere magnetiche non comportano le fasi di centrifugazione che possono causare forze di taglio che spezzano pezzi di DNA più lunghi. Ciò significa che i filamenti più lunghi di DNA rimangono intatti, il che è importante nei test genomici.
Orario di pubblicazione: 25 novembre 2022