Cryovialseru almennt notuð til að geyma frumulínur og önnur mikilvæg líffræðileg efni, í dewars fylltum með fljótandi köfnunarefni.

Það eru nokkur stig sem taka þátt í árangursríkri varðveislu frumna í fljótandi köfnunarefni. Þó að grundvallarreglan sé hæg frysting, þá fer nákvæmlega tæknin sem notuð er eftir frumugerðinni og frostvarnarefninu sem notað er. Það eru nokkur öryggissjónarmið og bestu starfsvenjur sem þarf að hafa í huga þegar frumur eru geymdar við svo lágt hitastig.

Þessi færsla miðar að því að gefa yfirsýn yfir hvernig frystiföt eru geymd í fljótandi köfnunarefni.

Hvað eru Cryovials

Cryovials eru lítil hettuglös með loki sem eru hönnuð til að geyma vökvasýni við mjög lágt hitastig. Þeir tryggja að frumur sem varðveittar eru í frostvörn komist ekki í beina snertingu við fljótandi köfnunarefni, sem lágmarkar hættuna á frumubrotum á meðan þeir njóta góðs af miklum kælandi áhrifum fljótandi köfnunarefnis.

Hettuglösin eru venjulega fáanleg í ýmsum stærðum og gerðum - þau geta verið snittari að innan eða utan með flötum eða ávölum botni. Sótthreinsuð og ósæfð snið eru einnig fáanleg.

Hver notarCyrovialsað geyma frumur í fljótandi köfnunarefni

Ýmsar NHS og einkarannsóknarstofur, auk rannsóknarstofnana sem sérhæfa sig í naflastrengsblóðbankastarfsemi, þekjufrumulíffræði, ónæmisfræði og stofnfrumulíffræði nota frystiföt til að frysta frumur.

Frumur sem varðveittar eru á þennan hátt eru B- og T-frumur, CHO-frumur, blóðmyndandi stofn- og stofnfrumur, blendingar, þarmafrumur, átfrumur, mesenchymal stofn- og stofnfrumur, einfrumur, mergæxli, NK frumur og fjölhæfar stofnfrumur.

Yfirlit yfir hvernig á að geyma Cryovials í fljótandi köfnunarefni

Kryovarðveisla er ferli sem varðveitir frumur og aðrar líffræðilegar byggingar með því að kæla þær niður í mjög lágt hitastig. Hægt er að geyma frumur í fljótandi köfnunarefni í mörg ár án þess að lífvænleiki frumunnar tapist. Þetta er yfirlit yfir verklagsreglurnar sem notaðar eru.

Frumuundirbúningur

Nákvæm aðferð til að útbúa sýni er mismunandi eftir frumugerð, en almennt er frumunum safnað saman og skilið í skilvindu til að mynda frumuríkan köggla. Þessi köggla er síðan endurleyst í flotinu sem blandað er við frostvörn eða frostvarnarefni.

Kryovarnarefni

Þessi miðill er notaður til að varðveita frumur í lághitaumhverfinu sem þær verða fyrir með því að hindra myndun innan- og utanfrumukristalla og þar með frumudauða. Hlutverk þeirra er að veita frumum og vefjum öruggt, verndandi umhverfi meðan á frystingu, geymslu og þíðingu stendur.

Miðli eins og ferskt frosið plasma (FFP), heparínbætt plasmalytlausn eða sermilausar, dýrahlutalausar lausnir er blandað saman við frostvarnarefni eins og dímetýlsúlfoxíð (DMSO) eða glýseról.

Endurvökvaða sýniskornið er skipt í pólýprópýlen kryoglas eins ogSuzhou Ace líflækningafyrirtæki Cryogenic Storage Vials.

Mikilvægt er að offylla ekki frystifötin þar sem það eykur hættuna á sprungum og hugsanlegri losun innihalds (1).

Stýrður frystihraði

Almennt er hægur stýrður frystihraði notaður fyrir farsæla frystingu frumna.

Eftir að sýnum hefur verið skipt í frystihettuglös eru þau sett á blautan ís eða í 4 ℃ kæliskáp og frystingin er hafin innan 5 mínútna. Til almennrar leiðbeiningar eru frumur kældar á hraðanum -1 til -3 á mínútu (2). Þetta er náð með því að nota forritanlegan kælir eða með því að setja hettuglös í einangruðum kassa sem er sett í –70°C til –90°C frysti með stýrðri hraða.

Flytja yfir í fljótandi köfnunarefni

Frosnu hettuglösin eru síðan flutt yfir í fljótandi köfnunarefnisgeymi í óákveðinn tíma að því tilskildu að hitastigi sem er minna en -135 ℃ haldist.

Þetta ofurlága hitastig er hægt að fá með því að dýfa í fljótandi eða gufufasa köfnunarefni.

Vökva- eða gufufasi?

Vitað er að geymsla í köfnunarefni í fljótandi fasa viðhaldi köldu hitastigi með algjörri samkvæmni, en oft er ekki mælt með því af eftirfarandi ástæðum:

• Þörfin fyrir mikið magn (dýpt) af fljótandi köfnunarefni sem er hugsanleg hætta. Bruni eða köfnun vegna þessa er raunveruleg hætta.
• Skjalfest tilvik um krossmengun af völdum smitefna eins og aspergillus, hep B og veiruútbreiðslu um fljótandi köfnunarefnismiðil (2,3)
• Möguleiki á að fljótandi köfnunarefni leki inn í hettuglösin við niðurdýfingu. Þegar það er tekið úr geymslu og hitað að stofuhita þenst köfnunarefnið hratt út. Þar af leiðandi getur hettuglasið splundrast þegar það er fjarlægt úr geymslu með fljótandi köfnunarefni, sem skapar hættu bæði af fljúgandi rusli og útsetningu fyrir innihaldinu (1, 4).

Af þessum ástæðum er geymsla við ofurlágt hitastig oftast í köfnunarefni í gufufasa. Þegar geyma þarf sýni í vökvafasanum skal nota sérhæfða cryoflex slöngur.

Gallinn við gufufasann er að lóðréttur hitastigull getur átt sér stað sem veldur hitasveiflum á milli -135 ℃ og -190 ℃. Þetta krefst vandlega og vandaðs eftirlits með magni fljótandi köfnunarefnis og hitabreytingum (5).

Margir framleiðendur mæla með því að frystiföt séu hentug til geymslu niður að -135 ℃ eða eingöngu til notkunar í gufufasa.

Þíða Cryopreserved frumurnar þínar

Þíðingaraðferðin er streituvaldandi fyrir frosna ræktun og rétta meðhöndlun og tækni er nauðsynleg til að tryggja hámarks lífvænleika, endurheimt og virkni frumanna. Nákvæmar þíðingarreglur munu ráðast af sérstökum frumugerðum. Hins vegar er hröð þíðing talin staðlað fyrir:

• Draga úr áhrifum á endurheimt frumna
• Hjálpaðu til við að draga úr útsetningartíma fyrir uppleystu efnin sem eru til staðar í frystimiðlinum
• Lágmarka skemmdir vegna endurkristöllunar íss

Vatnsböð, perluböð eða sérhæfð sjálfvirk tæki eru almennt notuð til að þíða sýni.

Oftast er 1 frumulína þídd í einu í 1-2 mínútur, með því að hringsnúast varlega í 37 ℃ vatnsbaði þar til aðeins lítill ís er eftir í hettuglasinu áður en þau eru þvegin í forhitaðri vaxtarmiðli.

Fyrir sumar frumur eins og spendýrafósturvísa er hæg hlýnun nauðsynleg til að lifa af.

Frumurnar eru nú tilbúnar til frumuræktunar, frumueinangrunar, eða ef um er að ræða blóðmyndandi stofnfrumur - lífvænleikarannsóknir til að tryggja heilleika gjafastofnfrumna fyrir mergeyðandi meðferð.

Það er eðlileg venja að taka litla skammta af forþvegna sýninu sem notað er til að framkvæma frumutalningu til að ákvarða frumustyrk til útflögunar í ræktun. Þú getur síðan metið niðurstöður frumueinangrunaraðferða og ákvarðað lífvænleika frumna.

Bestu starfshættir fyrir geymslu á Cryovials

Árangursrík frostvarðveisla sýna sem geymd eru í frystifötum fer eftir mörgum þáttum í samskiptareglunum, þar á meðal réttri geymslu og skráningu.

• Skiptu frumum á milli geymslustaða– Ef rúmmál leyfir skaltu skipta frumum á milli hettuglösa og geyma þær á aðskildum stöðum til að draga úr hættu á að sýni tapist vegna bilunar í búnaði.
• Komið í veg fyrir krossmengun– Veldu einnota sæfð hettuglös eða autoclave fyrir síðari notkun
• Notaðu hettuglös í viðeigandi stærð fyrir frumurnar þínar- hettuglös koma í magni á bilinu 1 til 5 ml. Forðist að offylla hettuglös til að draga úr hættu á sprungum.
• Veldu innri eða ytri snittari krýógen hettuglös– Sumir háskólar mæla með hettuglösum með innri snittu vegna öryggisráðstafana – þau geta einnig komið í veg fyrir mengun við áfyllingu eða þegar þau eru geymd í fljótandi köfnunarefni.
• Komið í veg fyrir leka- Notaðu tvísprautað innsigli mótað í skrúflokið eða O-hringa til að koma í veg fyrir leka og mengun.
• Notaðu 2D strikamerki og merki hettuglös– til að tryggja rekjanleika, gera hettuglös með stórum skrifflötum kleift að merkja hvert hettuglas með fullnægjandi hætti. 2D strikamerki geta hjálpað til við geymslustjórnun og skráningu. Litakóðaðar húfur eru gagnlegar til að auðvelda auðkenningu.
• Viðunandi viðhald á geymslum- Til að tryggja að frumur glatist ekki ættu geymsluílát að fylgjast stöðugt með hitastigi og fljótandi köfnunarefnisgildum. Viðvörun ætti að vera uppsett til að vara notendur við villum.

Öryggisráðstafanir

Fljótandi köfnunarefni hefur orðið algengt í nútíma rannsóknum en hefur hættu á alvarlegum meiðslum ef það er rangt notað.

Nota skal viðeigandi persónuhlífar (PPE) til að lágmarka hættu á frostbitum, bruna og öðrum skaðlegum atvikum við meðhöndlun fljótandi köfnunarefnis. Klæðist

• Cryogenic hanskar
• Rannsóknarstofufrakki
• Höggþolinn andlitshlíf sem hylur einnig hálsinn
• Lokaðir skór
• Skvettuheld plastsvunta

Ísskápar með fljótandi köfnunarefni ættu að vera á vel loftræstum svæðum til að lágmarka hættu á köfnun - köfnunarefni sem sleppur út gufar upp og flytur súrefni í andrúmsloftinu. Stórar geymslur ættu að hafa viðvörunarkerfi fyrir lágt súrefni.

Tilvalið er að vinna í pörum við meðhöndlun fljótandi köfnunarefnis og ætti að banna notkun þess utan venjulegs vinnutíma.

Cryovials til að styðja við vinnuflæðið þitt

Suzhou Ace Biomedical fyrirtæki býður upp á breitt úrval af vörum sem uppfylla frystingarþarfir þínar fyrir mismunandi tegundir frumna. Eignin inniheldur úrval af slöngum sem og úrval af dauðhreinsuðum frystifötum.

Cryovials okkar eru:

• Skrúfloka á rannsóknarstofu 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml Cryovial Cryogenic hettuglös Keilulaga botn Cryotub með þéttingu

  ● 0,5ml, 1,5ml, 2,0ml forskrift, með pilsi eða án pils
  ● Keilulaga eða sjálfstandandi hönnun, dauðhreinsuð eða ósæfð eru bæði fáanleg
  ● Skrúflokarör eru gerðar úr pólýprópýleni úr læknisfræði
  ● PP Cryotube hettuglös má endurtekið frysta og þíða
  ●Hönnun ytri loksins getur dregið úr líkum á mengun meðan á sýnismeðferð stendur.
  ● Skrúftappa Cryogenic rör Alhliða skrúfgangur til notkunar
  ● Slöngur passa við algengustu snúninga
  ● O-hringrör úr Cryogenic rör passa við venjuleg 1-tommu og 2-tommu, 48well, 81well, 96well og 100well frystibox
  ● Autoclavable að 121°C og frystanlegt að -86°C

  HLUTANR	EFNI	RÁÐMÁL	CAPLITUR	PCS/TOSKI	TÖSKUR/TÖSKUR
  ACT05-BL-N	PP	0,5ml	Svartur, gulur, blár, rauður, fjólublár, hvítur	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5ml	Svartur, gulur, blár, rauður, fjólublár, hvítur	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5ml	Svartur, gulur, blár, rauður, fjólublár, hvítur	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0ml	Svartur, gulur, blár, rauður, fjólublár, hvítur	500	10