Kjarnsýruútdráttur og segulperluaðferðin

Inngangur

Hvað er kjarnsýruútdráttur?

Í mjög einföldu máli er kjarnsýruútdráttur að fjarlægja RNA og/eða DNA úr sýni og allt umframmagn sem er ekki nauðsynlegt. Útdráttarferlið einangrar kjarnsýrurnar úr sýninu og gefur þær í formi óblandaðs skolvatns, laus við þynningarefni og aðskotaefni sem gætu haft áhrif á hvers kyns notkun á eftir.

Notkun kjarnsýruútdráttar

Hreinsaðar kjarnsýrur eru notaðar í ofgnótt af mismunandi forritum, allt í mörgum mismunandi atvinnugreinum. Heilbrigðisþjónusta er ef til vill það svæði þar sem hún er mest notuð, með hreinsað RNA og DNA sem þarf fyrir fjölda mismunandi prófana.

Notkun kjarnsýruútdráttar í heilbrigðisþjónustu eru:

- PCR og qPCR mögnun

- Next Generation Sequencing (NGS)

- SNP arfgerð sem byggir á mögnun

- Array-undirstaða arfgerð

- Takmörkun á ensímmeltingu

- Greinir með breytilegum ensímum (td tengingu og klónun)

Það eru líka önnur svið fyrir utan heilsugæslu þar sem kjarnsýruútdráttur er notaður, þar á meðal en ekki takmarkað við faðernispróf, réttarfræði og erfðafræði.

Stutt saga um kjarnsýruútdrátt

DNA útdrátturer langt aftur í tímann, en fyrsta þekkta einangrunin var framkvæmd af svissneskum lækni að nafni Friedrich Miescher árið 1869. Miescher var að vonast til að leysa grundvallarreglur lífsins með því að ákvarða efnasamsetningu frumna. Eftir að hafa misheppnast með eitilfrumur tókst honum að ná hráu botnfalli af DNA úr hvítfrumum sem fundust í gröftur á fleygðum sárabindum. Þetta gerði hann með því að bæta sýru og síðan basa í frumuna til að fara úr umfrymi frumunnar og þróaði síðan siðareglur til að skilja DNA frá hinum prótínunum.

Í kjölfar tímamótarannsókna Miescher hafa margir aðrir vísindamenn haldið áfram að þróa og þróa tækni til að einangra og hreinsa DNA. Edwin Joseph Cohn, próteinvísindamaður þróaði margar aðferðir til próteinhreinsunar á WW2. Hann var ábyrgur fyrir því að einangra sermi albúmínhlutann í blóðvökva, sem er mikilvægt til að viðhalda osmósuþrýstingi í æðum. Þetta var mikilvægt til að halda hermönnum á lífi.

Árið 1953 ákváðu Francis Crick, ásamt Rosalind Franklin og James Watson, uppbyggingu DNA, sem sýndi að það var byggt upp úr tveimur þráðum af löngum keðjum kjarnsýrukjarna. Þessi byltingarkennda uppgötvun ruddi brautina fyrir Meselson og Stahl, sem gátu þróað miðflóttaaðferð með þéttleikahalla til að einangra DNA frá E. Coli bakteríum þar sem þeir sýndu fram á hálf-íhaldssama afritun DNA í tilraun sinni árið 1958.

Aðferðir við kjarnsýruútdrátt

Hver eru 4 stig DNA útdráttar?
Allar útdráttaraðferðir sjóða niður í sömu grundvallarþrepunum.

Frumuröskun. Þetta stig, einnig þekkt sem frumulýs, felur í sér að brjóta niður frumuvegginn og/eða frumuhimnuna, til að losa innanfrumuvökvana sem innihalda kjarnsýrurnar sem áhugaverðar eru.

Fjarlægir óæskilegt rusl. Þetta felur í sér himnulípíð, prótein og aðrar óæskilegar kjarnsýrur sem geta truflað notkun síðar.

Einangrun. Það eru ýmsar mismunandi leiðir til að einangra kjarnsýrurnar sem þú hefur áhuga á frá hreinsaða lýsinu sem þú bjóst til, sem falla á milli tveggja meginflokka: lausnarbundið eða fast ástand (sjá næsta kafla).

Einbeiting. Eftir að kjarnsýrurnar hafa verið einangraðar frá öllum öðrum aðskotaefnum og þynningarefnum eru þær settar fram í mjög einbeittum skolvatni.

Tvær tegundir útdráttar
Það eru tvær tegundir af kjarnsýruútdrætti - lausnarmiðaðar aðferðir og fasta ástandsaðferðir. Lausnaraðferðin er einnig þekkt sem efnaútdráttaraðferðin, þar sem hún felur í sér að nota efni til að brjóta niður frumuna og fá aðgang að kjarnaefninu. Þetta getur verið að nota annaðhvort lífræn efnasambönd eins og fenól og klóróform, eða ólífræn efnasambönd sem eru minna skaðleg og því meira sem mælt er með eins og próteinasa K eða kísilgeli.

Dæmi um mismunandi efnaútdráttaraðferðir til að brjóta niður frumu eru:

- Osmótískt rof á himnu

- Ensímmelting frumuveggja

- Uppleysing himnu

- Með þvottaefni

- Með basameðferð

Fasta ástandstækni, einnig þekkt sem vélrænar aðferðir, felur í sér að nýta hvernig DNA hefur samskipti við fast hvarfefni. Með því að velja perlu eða sameind sem DNA mun bindast en greiniefnið mun ekki, er hægt að aðskilja þetta tvennt. Dæmi um fastfasa útdráttaraðferðir, þar á meðal notkun kísil og segulperlur.

Segulperluútdráttur útskýrður

Magnetic Bead Extract Method
Möguleikinn á útdrætti með því að nota segulmagnaðir perlur var fyrst viðurkenndur í bandarísku einkaleyfi sem Trevor Hawkins lagði fram fyrir rannsóknarstofnun Whitehead Institute. Þetta einkaleyfi viðurkenndi að hægt væri að vinna erfðaefni með því að binda það við fastan burðarbera, sem gæti verið segulmagnaðir perlur. Meginreglan er sú að þú notar mjög virka segulmagnaðir perlu sem erfðaefnið mun bindast við, sem síðan er hægt að skilja frá flotinu með því að beita segulkrafti utan á kerið sem geymir sýnið.

Af hverju að nota Magnetic Bead Extract?
Segulperluútdráttartækni er að verða sífellt algengari, vegna þeirra möguleika sem hún hefur fyrir hraðar og skilvirkar útdráttaraðferðir. Á seinni tímum hefur verið þróun á mjög hagnýtum segulperlum með hentugum biðminni, sem hafa gert mögulega sjálfvirkni kjarnsýruútdráttar og vinnuflæði sem er mjög auðlindalétt og hagkvæmt. Einnig fela segulmagnaðir perluútdráttaraðferðir ekki í sér skilvinduþrep sem geta valdið skurðarkraftum sem brjóta upp lengri DNA bita. Þetta þýðir að lengri DNA-strengir haldast ósnortnir, sem er mikilvægt við erfðafræðiprófanir.