Jafnvel þó að í orði væri ein sameind sniðmátsins nægjanlega, er talsvert stærra magn af DNA venjulega notað fyrir klassískt PCR, til dæmis allt að 1 µg af erfðafræðilegu DNA spendýra og eins lítið og 1 Pg af plasmíð DNA. Besta upphæðin veltur að miklu leyti á fjölda eintaka af markröðinni, sem og flækjustigi þess.
Ef mjög lítið sniðmát er notað verður þörf á samsvarandi aukningu á fjölda magnunarferða til að fá nægilegt magn af vöru. Taq fjölliðu sem er notað fyrir flestar PCR tilraunir er ekki með leiðréttingaraðgerð (3′-5 ′ exonuclease virkni); Þannig er ekki hægt að leiðrétta villur sem eiga sér stað við mögnun. Því hærri sem fjöldi lotna er, því algengari verður mögnun gölluðrar vöru. Ef aftur á móti er magn sniðmátsins of há, munu líkurnar á því að grunnarnir glitni til annarra (ekki hundrað prósent ókeypis) röð, svo og myndun grunnur dimers, aukast, sem mun leiða til þess að mögnunin á mögnun á mögnun aukaafurðir. Í mörgum tilvikum er DNA einangrað frá frumurækt eða frá örverum og síðan notað sem PCR sniðmát. Í kjölfar hreinsunar er nauðsynlegt að ákvarða styrk DNA til að geta skilgreint hljóðstyrkinn sem þarf til að skipuleggja PCR. Þó að rafskaut agarósagel geti þjónað til að veita mat er þessi aðferð langt frá því að vera nákvæm. UV-Vis litrófsmæling hefur verið staðfest sem gullstaðall til að mæla kjarnsýrur; Þessi bein og því auðveld og fljótleg aðferð mælir frásog sýnisins við 260 nm og styrkur er reiknaður með hjálp umbreytingarstuðuls.
Ef styrkur DNA er þó mjög lítill, þó (<1 µg/ml dsDNA), eða ef hann er mengaður af efnum sem einnig taka upp á 260 nm sviðinu (EG RNA, prótein, sölt), mun þessi aðferð ná takmörkunum. Þegar um er að ræða mjög lágan styrk verða aflestrarnir brátt of ónákvæmir til að nýtast og mengun mun leiða til (stundum gríðarlegrar) ofmats á raunverulegu gildi. Í þessu tilfelli getur magngreining með flúrljómun valdið vali. Þessi tækni er byggð á notkun flúrperu sem bindur sérstaklega við dsDNA aðeins flókið sem samanstendur af kjarnsýru og litarefni er spennt fyrir ljósinu og hún mun í kjölfarið gefa frá sér ljós af aðeins hærri bylgjulengd. Hér er styrkleiki flúrperunnar í réttu hlutfalli við magn DNA og til að ákvarða styrkinn er það metið í tengslum við staðalferil. Kostir þessarar aðferðar hvíla á sérstöðu bindisins, sem útilokar ytri áhrif sem kynnt var með mengun, sem og á þeim getu til að greina mjög lágan styrk DNA. Hæfni hvorrar aðferðar veltur aðallega á styrk sýnisins og hreinleika; Í mörgum tilvikum getur jafnvel verið ráðlegt að beita báðum aðferðum samhliða.
Post Time: Nóv-30-2022