Agar reaksi amplifikasi berhasil, masing-masing komponen reaksi harus ada dalam konsentrasi yang tepat di setiap sediaan. Selain itu, penting agar tidak terjadi kontaminasi.
Terutama ketika banyak reaksi harus diatur, telah ditetapkan untuk menyiapkan apa yang disebut campuran induk (master mix) daripada memipet setiap reagen secara terpisah ke dalam setiap bejana. Campuran yang telah dikonfigurasi sebelumnya tersedia secara komersial, yang hanya menambahkan komponen spesifik sampel (primer) dan air. Sebagai alternatif, campuran utama dapat disiapkan sendiri. Pada kedua varian, campuran didistribusikan ke setiap wadah PCR tanpa templat dan sampel DNA individu ditambahkan secara terpisah di bagian akhir.
Penggunaan campuran master memiliki beberapa keuntungan: Pertama, jumlah langkah pemipetan tunggal berkurang. Dengan cara ini, risiko kesalahan pengguna selama pemipetan dan risiko kontaminasi dapat diminimalkan dan, tentu saja, menghemat waktu. Pada prinsipnya, keakuratan pemipetan juga lebih tinggi, karena volume yang diberi dosis lebih besar. Hal ini mudah dipahami saat memeriksa data teknis pipet: Semakin kecil volume takarannya, semakin tinggi penyimpangannya. Fakta bahwa semua sediaan berasal dari wadah yang sama memiliki efek positif pada homogenitas (jika tercampur dengan baik). Hal ini juga meningkatkan reproduktifitas eksperimen.
Saat menyiapkan campuran induk, setidaknya 10 % volume ekstra harus ditambahkan (misalnya jika diperlukan 10 persiapan, hitung berdasarkan 11), sehingga bejana terakhir pun terisi dengan benar. Dengan cara ini, (sedikit) ketidakakuratan pemipaan, dan efek hilangnya sampel saat pemberian dosis larutan yang mengandung deterjen dapat dikompensasi. Deterjen terkandung dalam larutan enzim seperti polimerase dan campuran utama, menyebabkan pembentukan busa dan residu pada permukaan bagian dalam normal.ujung pipet.
Tergantung pada aplikasi dan jenis cairan yang akan disalurkan, teknik pemipetan yang benar (1) harus dipilih dan peralatan yang sesuai harus dipilih. Untuk larutan yang mengandung deterjen, disarankan menggunakan sistem perpindahan langsung atau yang disebut ujung pipet “retensi rendah” sebagai alternatif pipet bantalan udara. Efek dariUjung PIPET ACEdidasarkan pada permukaan yang sangat hidrofobik. Cairan yang mengandung deterjen tidak meninggalkan lapisan sisa baik di dalam maupun di luar, sehingga hilangnya larutan dapat diminimalkan.
Selain dosis yang tepat untuk semua komponen, penting juga agar tidak terjadi kontaminasi pada sediaan. Tidak cukup menggunakan bahan habis pakai dengan kemurnian tinggi, karena proses pemipetan pada pipet bantalan udara dapat menghasilkan aerosol yang tertinggal di dalam pipet. DNA yang mungkin terkandung dalam aerosol dapat dipindahkan dari satu sampel ke sampel berikutnya dalam langkah pemipetan berikutnya sehingga menyebabkan kontaminasi. Sistem perpindahan langsung yang disebutkan di atas juga dapat meminimalkan risiko ini. Untuk pipet bantalan udara, sebaiknya gunakan ujung filter untuk melindungi kerucut pipet dengan menahan percikan, aerosol, dan biomolekul.
Waktu posting: 06 Des-2022