Standarisasi proses mencakup optimalisasi dan pembentukan serta harmonisasi selanjutnya, yang memungkinkan kinerja optimal jangka panjang – tidak bergantung pada pengguna. Standardisasi memastikan hasil berkualitas tinggi, serta reproduktifitas dan komparabilitasnya.
Tujuan PCR (klasik) adalah menghasilkan hasil yang andal dan dapat direproduksi. Untuk aplikasi tertentu, hasil dariproduk PCRjuga relevan. Untuk reaksi ini, kehati-hatian harus diberikan untuk memastikan bahwa sampel tidak terganggu dan alur kerja PCR tetap stabil. Secara khusus, hal ini berarti meminimalkan masuknya kontaminasi yang dapat menyebabkan hasil positif palsu atau negatif palsu atau bahkan menghambat reaksi PCR. Selain itu, kondisi reaksi harus seidentik mungkin untuk masing-masing sampel dalam suatu proses dan juga dapat ditransfer ke reaksi berikutnya (dengan metode yang sama). Hal ini mengacu pada komposisi reaksi serta jenis kontrol suhu dalam cycler. Kesalahan pengguna, tentu saja, harus dihindari sebisa mungkin.
Di bawah ini, kami akan menunjukkan tantangan yang dihadapi selama persiapan dan selama menjalankan PCR – dan pendekatan solusi yang ada sehubungan dengan instrumen dan bahan habis pakai yang digunakan untuk standarisasi alur kerja PCR.
Persiapan reaksi
Penyaluran komponen reaksi ke dalam bejana PCR, atau pelat, memiliki beberapa tantangan yang harus diatasi:
Kondisi reaksi
Dosis masing-masing komponen yang tepat dan tepat sangat diperlukan untuk mencapai kondisi reaksi yang paling identik. Selain teknik pemipetan yang baik, pemilihan alat yang tepat juga penting. Campuran induk PCR sering kali mengandung zat yang meningkatkan viskositas atau menghasilkan busa. Selama proses pemipetan, hal ini menyebabkan pembasahan yang cukup besarujung pipet, sehingga mengurangi akurasi pemipetan. Penggunaan sistem penyaluran langsung atau ujung pipet alternatif yang tidak mudah basah dapat meningkatkan akurasi dan presisi proses pemipetan.
Kontaminasi
Selama proses penyaluran, akan dihasilkan aerosol yang jika dibiarkan mencapai bagian dalam pipet, berpotensi mengkontaminasi sampel lain pada langkah pemipetan berikutnya. Hal ini dapat dicegah dengan menggunakan ujung filter atau sistem perpindahan langsung.
Bahan habis pakai sepertitip, wadah dan pelat yang digunakan dalam alur kerja PCR tidak boleh mengandung zat yang membahayakan sampel atau memalsukan hasil. Hal ini mencakup DNA, DNase, RNases, dan penghambat PCR, serta komponen yang berpotensi terlepas dari bahan selama reaksi – zat yang dikenal sebagai bahan yang dapat larut.
Kesalahan pengguna
Semakin banyak sampel yang diproses, semakin tinggi risiko kesalahannya. Dapat dengan mudah terjadi bahwa sampel dipipet ke wadah yang salah atau sumur yang salah. Risiko ini dapat dikurangi secara signifikan dengan penandaan sumur yang mudah terlihat. Melalui otomatisasi langkah-langkah penyaluran, “faktor manusia”, yaitu kesalahan dan variasi terkait pengguna, diminimalkan, sehingga meningkatkan reproduktifitas, terutama dalam kasus volume reaksi yang kecil. Hal ini memerlukan pelat dengan stabilitas dimensi yang cukup untuk digunakan di stasiun kerja. Barcode yang terlampir memberikan keterbacaan mesin tambahan, yang menyederhanakan pelacakan sampel di seluruh proses.
Pemrograman termosiklik
Memprogram suatu instrumen terbukti memakan waktu dan juga rawan kesalahan. Berbagai fitur thermal cycler PCR bekerja sama untuk menyederhanakan langkah proses ini dan, yang paling penting, membuatnya aman:
Pengoperasian yang mudah dan panduan pengguna yang baik adalah dasar dari pemrograman yang efisien. Berdasarkan landasan ini, administrasi pengguna yang dilindungi kata sandi akan mencegah programnya diubah oleh pengguna lain. Jika beberapa cycler (dari jenis yang sama) digunakan, akan bermanfaat jika suatu program dapat ditransfer langsung dari satu instrumen ke instrumen lainnya melalui USB atau konektivitas. Perangkat lunak komputer memungkinkan administrasi program, hak pengguna, dan dokumen secara terpusat dan aman di komputer.
PCR dijalankan
Selama proses, DNA diamplifikasi dalam bejana reaksi, di mana setiap sampel harus diberikan kondisi reaksi yang identik dan konsisten. Aspek-aspek berikut ini relevan untuk proses tersebut:
Kontrol suhu
Akurasi yang sangat baik dalam kontrol suhu dan homogenitas blok cycler adalah dasar untuk pengkondisian suhu yang merata pada semua sampel. Kualitas tinggi elemen pemanas dan pendingin (elemen peltier), serta cara elemen tersebut dihubungkan ke blok, merupakan faktor penentu yang akan menentukan risiko perbedaan suhu yang dikenal sebagai “efek tepi”
Penguapan
Konsentrasi masing-masing komponen reaksi tidak boleh berubah selama reaksi akibat penguapan. Jika tidak, kemungkinannya sangat sedikitproduk PCRdapat dihasilkan, atau tidak sama sekali. Oleh karena itu, penting untuk meminimalkan penguapan dengan memastikan segel yang aman. Dalam hal ini, tutup thermocycler yang dipanaskan dan segel bejana bekerja sama. Opsi penyegelan yang berbeda tersedia untukPelat PCR (tautan: Artikel penyegelan), dimana segel terbaik dicapai melalui penyegelan panas. Penutupan lain mungkin juga cocok, asalkan tekanan kontak tutup cycler dapat disesuaikan dengan segel yang dipilih.
Standarisasi proses diterapkan untuk menjaga hasil yang akurat dan dapat direproduksi dalam jangka panjang. Hal ini mencakup perawatan berkala terhadap peralatan untuk memastikan peralatan selalu dalam kondisi kerja yang baik. Semua bahan habis pakai harus memiliki kualitas tinggi secara konsisten di semua lot yang diproduksi, dan ketersediaannya yang dapat diandalkan harus terjamin.
Waktu posting: 29 November 2022