Perkenalan
Apa itu Ekstraksi Asam Nukleat?
Dalam istilah yang paling sederhana, ekstraksi asam nukleat adalah penghilangan RNA dan/atau DNA dari sampel dan semua kelebihan yang tidak diperlukan. Proses ekstraksi mengisolasi asam nukleat dari sampel dan menghasilkannya dalam bentuk eluat pekat, bebas dari pengencer dan kontaminan yang dapat mempengaruhi aplikasi hilir.
Aplikasi Ekstraksi Asam Nukleat
Asam nukleat yang dimurnikan digunakan dalam berbagai aplikasi berbeda, di berbagai industri berbeda. Layanan kesehatan mungkin merupakan bidang yang paling banyak menggunakannya, karena RNA dan DNA yang dimurnikan diperlukan untuk sejumlah tujuan pengujian yang berbeda.
Aplikasi ekstraksi asam nukleat dalam perawatan kesehatan meliputi:
- Urutan Generasi Berikutnya (NGS)
- Genotipe SNP berbasis amplifikasi
- Genotipe berbasis array
- Pembatasan Pencernaan Enzim
- Analisis menggunakan Enzim Pengubah (misalnya Ligasi dan Kloning)
Ada juga bidang lain di luar perawatan kesehatan yang menggunakan ekstraksi asam nukleat, termasuk namun tidak terbatas pada pengujian garis ayah, forensik, dan genomik.
Sejarah Singkat Ekstraksi Asam Nukleat
Ekstraksi DNAsudah ada sejak lama, dengan isolasi pertama yang diketahui dilakukan oleh seorang dokter Swiss bernama Friedrich Miescher pada tahun 1869. Miescher berharap dapat memecahkan prinsip-prinsip dasar kehidupan dengan menentukan komposisi kimiawi sel. Setelah gagal dengan limfosit, ia dapat memperoleh endapan kasar DNA dari leukosit yang ditemukan dalam nanah pada perban yang dibuang. Dia melakukan ini dengan menambahkan asam dan kemudian alkali ke dalam sel untuk meninggalkan sitoplasma sel, dan kemudian mengembangkan protokol untuk memisahkan DNA dari protein lainnya.
Setelah penelitian inovatif Miescher, banyak ilmuwan lain yang memajukan dan mengembangkan teknik untuk mengisolasi dan memurnikan DNA. Edwin Joseph Cohn, seorang ilmuwan protein mengembangkan banyak teknik pemurnian protein selama Perang Dunia II. Dia bertanggung jawab untuk mengisolasi fraksi albumin serum dari plasma darah, yang penting dalam menjaga tekanan osmotik di pembuluh darah. Ini penting untuk menjaga agar tentara tetap hidup.
Pada tahun 1953 Francis Crick, bersama dengan Rosalind Franklin dan James Watson, menentukan struktur DNA, menunjukkan bahwa DNA terdiri dari dua untai rantai panjang nukleotida asam nukleat. Penemuan terobosan ini membuka jalan bagi Meselson dan Stahl, yang mampu mengembangkan protokol sentrifugasi gradien kepadatan untuk mengisolasi DNA dari bakteri E. Coli saat mereka mendemonstrasikan replikasi DNA semi-konservatif selama percobaan mereka pada tahun 1958.
Teknik Ekstraksi Asam Nukleat
Apa saja 4 tahap ekstraksi DNA?
Semua metode ekstraksi memiliki langkah dasar yang sama.
Gangguan Sel. Tahap ini, juga dikenal sebagai lisis sel, melibatkan penguraian dinding sel dan/atau membran sel, untuk melepaskan cairan intraseluler yang mengandung asam nukleat yang diinginkan.
Penghapusan Puing yang Tidak Diinginkan. Ini termasuk lipid membran, protein dan asam nukleat lain yang tidak diinginkan yang dapat mengganggu aplikasi hilir.
Isolasi. Ada sejumlah cara berbeda untuk mengisolasi asam nukleat yang diinginkan dari lisat bersih yang Anda buat, yang terbagi dalam dua kategori utama: berbasis larutan atau wujud padat (lihat bagian selanjutnya).
Konsentrasi. Setelah asam nukleat diisolasi dari semua kontaminan dan pengencer lainnya, asam nukleat disajikan dalam eluat dengan konsentrasi tinggi.
Dua Jenis Ekstraksi
Ada dua jenis ekstraksi asam nukleat – metode berbasis larutan dan metode keadaan padat. Metode berbasis larutan juga dikenal sebagai metode ekstraksi kimia, karena melibatkan penggunaan bahan kimia untuk memecah sel dan mengakses bahan nukleat. Hal ini dapat menggunakan senyawa organik seperti fenol dan kloroform, atau senyawa anorganik yang kurang berbahaya sehingga lebih direkomendasikan seperti Proteinase K atau silika gel.
Contoh metode ekstraksi kimia yang berbeda untuk memecah sel meliputi:
- Pecahnya membran secara osmotik
- Pencernaan enzimatik pada dinding sel
- Pelarutan membran
- Dengan deterjen
- Dengan pengobatan alkali
Teknik keadaan padat, juga dikenal sebagai metode mekanis, melibatkan eksploitasi bagaimana DNA berinteraksi dengan substrat padat. Dengan memilih manik atau molekul yang akan diikatkan oleh DNA tetapi analitnya tidak, keduanya dapat dipisahkan. Contoh teknik ekstraksi fasa padat antara lain menggunakan silika dan manik magnet.
Ekstraksi Manik Magnetik Dijelaskan
Metode Ekstraksi Manik Magnetik
Potensi ekstraksi menggunakan manik-manik magnetik pertama kali diketahui dalam paten AS yang diajukan oleh Trevor Hawkins, untuk lembaga penelitian Whitehead Institute. Paten ini mengakui bahwa ekstraksi materi genetik dapat dilakukan dengan mengikatnya pada pembawa pendukung padat, yang dapat berupa manik magnetis. Prinsipnya adalah Anda menggunakan manik magnetis yang sangat berfungsi di mana materi genetik akan diikat, yang kemudian dapat dipisahkan dari supernatan dengan menerapkan gaya magnet ke bagian luar wadah yang menampung sampel.
Mengapa Menggunakan Ekstraksi Manik Magnetik?
Teknologi ekstraksi manik magnetik menjadi semakin umum karena potensi yang dimilikinya untuk prosedur ekstraksi yang cepat dan efisien. Belakangan ini telah terjadi pengembangan manik-manik magnetik yang sangat fungsional dengan sistem buffer yang sesuai, yang memungkinkan otomatisasi ekstraksi asam nukleat dan alur kerja yang sangat ringan dan hemat biaya. Selain itu, metode ekstraksi manik magnetik tidak melibatkan langkah sentrifugasi yang dapat menyebabkan gaya geser yang memecah potongan DNA yang lebih panjang. Ini berarti untaian DNA yang lebih panjang tetap utuh, yang penting dalam pengujian genomik.
Waktu posting: 25 November-2022