Meskipun secara teori, satu molekul template akan cukup, jumlah DNA yang jauh lebih besar biasanya digunakan untuk PCR klasik, misalnya, hingga 1 μg DNA mamalia genom dan sesedikit pg DNA plasmid. Jumlah optimal sangat tergantung pada jumlah salinan dari urutan target, serta kompleksitasnya.
Jika template yang sangat sedikit digunakan, peningkatan yang sesuai dalam jumlah siklus amplifikasi akan diperlukan untuk mendapatkan jumlah produk yang cukup. TAQ polimerase yang digunakan untuk sebagian besar percobaan PCR tidak memiliki fungsi koreksi (3′-5 ′ aktivitas eksonuklease); Dengan demikian, kesalahan yang terjadi selama amplifikasi tidak dapat diperbaiki. Semakin tinggi jumlah siklus, semakin umum amplifikasi produk cacat. Jika, di sisi lain, jumlah templat terlalu tinggi, probabilitas primer yang dianek ke urutan lain (bukan seratus persen gratis), serta pembentukan dimer primer, akan meningkat, yang akan menghasilkan amplifikasi dari produk sampingan. Dalam banyak kasus, DNA diisolasi dari kultur sel atau dari mikroorganisme dan kemudian digunakan sebagai templat PCR. Setelah pemurnian, perlu untuk menentukan konsentrasi DNA untuk dapat menentukan volume yang diperlukan untuk pengaturan PCR. Sementara elektroforesis gel agarosa dapat berfungsi untuk memberikan perkiraan, metode ini jauh dari akurat. Spektrofotometri UV-VIS telah ditetapkan sebagai standar emas untuk kuantifikasi asam nukleat; Metode langsung dan karenanya mudah dan cepat ini mengukur absorbansi sampel pada 260 nm, dan konsentrasi dihitung dengan bantuan faktor konversi.
Namun, jika konsentrasi DNA sangat rendah (<1 μg/mL dsDNA), atau jika terkontaminasi dengan zat yang juga menyerap dalam kisaran 260 nM (misalnya RNA, protein, garam), metode ini akan mencapai keterbatasannya. Dalam kasus konsentrasi yang sangat rendah, bacaan akan segera menjadi terlalu tidak akurat untuk digunakan, dan kontaminasi akan menyebabkan perkiraan yang terlalu tinggi dari nilai aktual. Dalam hal ini, kuantifikasi menggunakan fluoresensi dapat menghadirkan alternatif. Teknik ini didasarkan pada penggunaan pewarna fluoresen yang mengikat secara khusus dengan dsDNA hanya kompleks yang terdiri dari asam nukleat dan pewarna yang tereksitasi oleh cahaya, dan kemudian akan memancarkan cahaya dengan panjang gelombang yang sedikit lebih tinggi. Di sini, intensitas sinyal fluoresen sebanding dengan jumlah DNA, dan untuk menentukan konsentrasi yang dievaluasi dalam kaitannya dengan kurva standar. Keuntungan dari metode ini bertumpu pada spesifisitas ikatan, yang tidak termasuk pengaruh eksternal yang diperkenalkan oleh kontaminasi, serta pada kemampuan yang dihasilkan untuk mendeteksi konsentrasi DNA yang sangat rendah. Kesesuaian salah satu metode tergantung terutama pada konsentrasi dan kemurnian sampel; Dalam banyak kasus bahkan mungkin disarankan untuk menerapkan kedua metode secara paralel.
Waktu posting: Nov-30-2022