Ներածություն
Ի՞նչ է նուկլեինաթթվի արդյունահանումը:
Ամենապարզ տերմիններով, նուկլեինաթթվի արդյունահանումը նմուշից ՌՆԹ-ի և/կամ ԴՆԹ-ի և այն ավելցուկի հեռացումն է, որն անհրաժեշտ չէ: Արդյունահանման գործընթացը նմուշից մեկուսացնում է նուկլեինաթթուները և դրանք տալիս է խտացված լուծույթի տեսքով՝ զերծ լուծիչներից և աղտոտիչներից, որոնք կարող են ազդել ներքևում գտնվող ցանկացած կիրառման վրա:
Նուկլեինաթթվի արդյունահանման կիրառությունները
Մաքրված նուկլեինաթթուները օգտագործվում են բազմաթիվ տարբեր կիրառություններում, որոնք տատանվում են բազմաթիվ տարբեր ոլորտներում: Առողջապահությունը, թերևս, այն տարածքն է, որտեղ այն օգտագործվում է ամենից շատ՝ մաքրված ՌՆԹ-ով և ԴՆԹ-ով, որոնք անհրաժեշտ են տարբեր փորձարկման նպատակների համար:
Առողջապահության մեջ նուկլեինաթթվի արդյունահանման կիրառությունները ներառում են.
- Հաջորդ սերնդի հաջորդականություն (NGS)
- ուժեղացման վրա հիմնված SNP գենոտիպավորում
- Զանգվածի վրա հիմնված գենոտիպավորում
- Սահմանափակման ֆերմենտի մարսողություն
- Վերլուծություններ՝ օգտագործելով փոփոխող ֆերմենտներ (օրինակ՝ կապակցում և կլոնավորում)
Առողջապահությունից դուրս կան նաև այլ ոլորտներ, որտեղ օգտագործվում է նուկլեինաթթվի արդյունահանումը, ներառյալ հայրության թեստավորումը, դատաբժշկական փորձաքննությունը և գենոմիկան:
Նուկլեինաթթվի արդյունահանման համառոտ պատմություն
ԴՆԹ արդյունահանումթվագրվում է շատ վաղուց, երբ առաջին հայտնի մեկուսացումն իրականացվել է շվեյցարացի բժիշկ Ֆրիդրիխ Միշերի կողմից 1869 թվականին: Միշերը հույս ուներ լուծել կյանքի հիմնարար սկզբունքները՝ որոշելով բջիջների քիմիական կազմը: Լիմֆոցիտների հետ կապված ձախողումից հետո նա կարողացավ ԴՆԹ-ի անմշակ նստվածք ստանալ լեյկոցիտներից, որոնք հայտնաբերված էին թարախի մեջ դեն նետված վիրակապերի վրա: Նա դա արեց՝ բջիջին թթու, ապա ալկալի ավելացնելով, որպեսզի դուրս գա բջջի ցիտոպլազմայից, իսկ հետո մշակեց արձանագրություն՝ ԴՆԹ-ն մյուս սպիտակուցներից առանձնացնելու համար:
Միշերի բեկումնային հետազոտություններից հետո շատ այլ գիտնականներ առաջ են անցել և մշակել ԴՆԹ-ի մեկուսացման և մաքրման տեխնիկա: Սպիտակուցների գիտնական Էդվին Ջոզեֆ Կոնը Երկրորդ համաշխարհային պատերազմի ընթացքում սպիտակուցների մաքրման բազմաթիվ մեթոդներ է մշակել: Նա պատասխանատու էր արյան պլազմայի շիճուկի ալբումինի ֆրակցիայի մեկուսացման համար, որը կարևոր է արյան անոթներում օսմոտիկ ճնշումը պահպանելու համար։ Սա վճռորոշ էր զինվորներին կենդանի պահելու համար։
1953 թվականին Ֆրենսիս Քրիկը Ռոզալինդ Ֆրանկլինի և Ջեյմս Ուոթսոնի հետ որոշեց ԴՆԹ-ի կառուցվածքը՝ ցույց տալով, որ այն բաղկացած է նուկլեինաթթվի նուկլեոտիդների երկար շղթաներից։ Այս բեկումնային հայտնագործությունը ճանապարհ հարթեց Մեսելսոնի և Ստալի համար, ովքեր կարողացան մշակել խտության գրադիենտ ցենտրիֆուգման արձանագրություն՝ E. Coli բակտերիայից ԴՆԹ-ից մեկուսացնելու համար, քանի որ նրանք ցուցադրեցին ԴՆԹ-ի կիսապահպանողական վերարտադրությունը իրենց 1958 թվականի փորձի ժամանակ:
Նուկլեինաթթվի արդյունահանման տեխնիկա
Որո՞նք են ԴՆԹ-ի արդյունահանման 4 փուլերը:
Արդյունահանման բոլոր մեթոդները հանգում են նույն հիմնարար քայլերին:
Բջջի խանգարում. Այս փուլը, որը նաև հայտնի է որպես բջիջների լիզ, ներառում է բջջային պատի և/կամ բջջային թաղանթի քայքայումը՝ հետաքրքրող նուկլեինաթթուներ պարունակող ներբջջային հեղուկների ազատման նպատակով:
Անցանկալի բեկորների հեռացում. Սա ներառում է թաղանթային լիպիդներ, սպիտակուցներ և այլ անցանկալի նուկլեինաթթուներ, որոնք կարող են խանգարել ներքևի կիրառմանը:
Մեկուսացում։ Ձեր ստեղծած մաքրված լիզատից հետաքրքրող նուկլեինաթթուները մեկուսացնելու մի շարք տարբեր եղանակներ կան, որոնք դասվում են երկու հիմնական կատեգորիաների՝ լուծույթի վրա հիմնված կամ պինդ վիճակի (տես հաջորդ բաժինը):
Համակենտրոնացում. Այն բանից հետո, երբ նուկլեինաթթուները մեկուսացված են մյուս բոլոր աղտոտիչներից և նոսրացուցիչներից, դրանք ներկայացվում են բարձր խտացված էլուատում:
Արդյունահանման երկու տեսակները
Գոյություն ունի նուկլեինաթթվի արդյունահանման երկու տեսակ՝ լուծույթի վրա հիմնված և պինդ վիճակի մեթոդներ: Լուծման վրա հիմնված մեթոդը հայտնի է նաև որպես քիմիական արդյունահանման մեթոդ, քանի որ այն ներառում է քիմիական նյութերի օգտագործումը բջիջը քայքայելու և նուկլեինային նյութին մուտք գործելու համար: Սա կարող է լինել կամ օրգանական միացությունների օգտագործումը, ինչպիսիք են ֆենոլը և քլորոֆորմը, կամ ավելի քիչ վնասակար և, հետևաբար, ավելի շատ առաջարկվող անօրգանական միացությունները, ինչպիսիք են Proteinase K-ը կամ սիլիկա գելը:
Բջիջը քայքայելու տարբեր քիմիական արդյունահանման մեթոդների օրինակներ ներառում են.
- թաղանթի օսմոտիկ պատռվածք
- Բջջային պատի ֆերմենտային մարսողություն
- թաղանթի լուծարում
- Լվացող միջոցներով
- Ալկալիների բուժման հետ
Պինդ վիճակի տեխնիկան, որը նաև հայտնի է որպես մեխանիկական մեթոդներ, ներառում է ԴՆԹ-ի փոխազդեցության օգտագործումը պինդ սուբստրատի հետ: Ընտրելով մի հատիկ կամ մոլեկուլ, որի հետ ԴՆԹ-ն կկապվի, իսկ անալիտը՝ ոչ, հնարավոր է առանձնացնել այդ երկուսը: Կոշտ փուլով արդյունահանման տեխնիկայի օրինակներ, ներառյալ սիլիցիումի և մագնիսական ուլունքների օգտագործումը:
Բացատրված է մագնիսական բշտիկի արդյունահանումը
Մագնիսական բշտիկների արդյունահանման մեթոդը
Մագնիսական ուլունքների միջոցով արդյունահանման հնարավորությունը առաջին անգամ ճանաչվել է ԱՄՆ արտոնագրում, որը ներկայացրել է Թրևոր Հոքինսը, Ուայթհեդի ինստիտուտի հետազոտական հաստատության համար: Այս արտոնագիրը հաստատում էր, որ հնարավոր է գենետիկական նյութ կորզել՝ դրանք կապելով ամուր հենարանի կրիչի հետ, որը կարող է լինել մագնիսական բշտիկ։ Սկզբունքն այն է, որ դուք օգտագործում եք բարձր ֆունկցիոնալ մագնիսական բշտիկ, որի վրա կկապվի գենետիկական նյութը, որն այնուհետև կարելի է առանձնացնել վերին հեղուկից՝ մագնիսական ուժ կիրառելով նմուշը պահող նավի արտաքին մասում:
Ինչու՞ օգտագործել մագնիսական բշտիկների արդյունահանումը:
Մագնիսական ուլունքների արդյունահանման տեխնոլոգիան գնալով ավելի տարածված է դառնում՝ շնորհիվ արդյունահանման արագ և արդյունավետ ընթացակարգերի ներուժի: Վերջին ժամանակներում տեղի են ունեցել բարձր ֆունկցիոնալ մագնիսական ուլունքների զարգացումներ՝ համապատասխան բուֆերային համակարգերով, որոնք հնարավոր են դարձրել նուկլեինաթթվի արդյունահանման ավտոմատացումը և աշխատանքային հոսքը, որը ռեսուրսների շատ թեթև և ծախսարդյունավետ է: Բացի այդ, մագնիսական բշտիկների արդյունահանման մեթոդները չեն ներառում ցենտրիֆուգացման քայլեր, որոնք կարող են առաջացնել կտրող ուժեր, որոնք կոտրում են ԴՆԹ-ի ավելի երկար կտորներ: Սա նշանակում է, որ ԴՆԹ-ի ավելի երկար շղթաները մնում են անձեռնմխելի, ինչը կարևոր է գենոմիկայի փորձարկումներում:
Հրապարակման ժամանակը՝ նոյ-25-2022