Թեև տեսականորեն կաղապարի մեկ մոլեկուլը բավարար է, դասական ՊՇՌ-ի համար սովորաբար օգտագործվում են զգալիորեն ավելի մեծ քանակությամբ ԴՆԹ, օրինակ՝ մինչև 1 մկգ կաթնասունների գենոմային ԴՆԹ և 1 պգ պլազմիդային ԴՆԹ: Օպտիմալ քանակությունը մեծապես կախված է թիրախային հաջորդականության կրկնօրինակների քանակից, ինչպես նաև դրա բարդությունից:
Եթե կաղապարը շատ քիչ է օգտագործվում, ապա բավարար քանակի արտադրանք ստանալու համար անհրաժեշտ կլինի ուժեղացման ցիկլերի քանակի համապատասխան աճ: Taq պոլիմերազը, որն օգտագործվում է PCR փորձերի մեծ մասի համար, չունի ուղղիչ ֆունկցիա (3'-5' էկզոնուկլեազային ակտիվություն); Այսպիսով, ուժեղացման ժամանակ առաջացող սխալները չեն կարող ուղղվել: Որքան մեծ է ցիկլերի քանակը, այնքան ավելի տարածված կլինի թերի արտադրանքի ուժեղացումը: Եթե, մյուս կողմից, կաղապարի քանակությունը չափազանց մեծ է, ապա կմեծանա այբբենարանների այլ (ոչ հարյուր տոկոս հավելյալ) հաջորդականությունների վրա կռելու հավանականությունը, ինչպես նաև այբբենարանի դիմերների ձևավորումը, ինչը կհանգեցնի ուժեղացման: ենթամթերքներ. Շատ դեպքերում ԴՆԹ-ն մեկուսացվում է բջջային կուլտուրաներից կամ միկրոօրգանիզմներից և այնուհետև օգտագործվում որպես PCR ձևանմուշ: Մաքրումից հետո անհրաժեշտ է որոշել ԴՆԹ-ի կոնցենտրացիան, որպեսզի կարողանանք որոշել այն ծավալը, որն անհրաժեշտ է PCR-ի տեղադրման համար: Թեև ագարոզայի գելի էլեկտրոֆորեզը կարող է ծառայել գնահատական տալու համար, այս մեթոդը հեռու է ճշգրիտ լինելուց: UV-Vis սպեկտրոֆոտոմետրիան հաստատվել է որպես նուկլեինաթթուների քանակական որոշման ոսկե ստանդարտ; Այս ուղղակի և հետևաբար հեշտ և արագ մեթոդը չափում է նմուշի կլանումը 260 նմ-ում, և կոնցենտրացիան հաշվարկվում է փոխակերպման գործակցի օգնությամբ:
Այնուամենայնիվ, եթե ԴՆԹ-ի կոնցենտրացիան շատ ցածր է (< 1 μg/mL dsDNA), կամ եթե այն աղտոտված է նյութերով, որոնք նույնպես ներծծվում են 260 նմ միջակայքում (օրինակ՝ ՌՆԹ, սպիտակուց, աղեր), այս մեթոդը կհասնի իր սահմանափակումներին: Շատ ցածր կոնցենտրացիաների դեպքում ցուցումները շուտով կդառնան չափազանց անճշտ՝ կիրառման համար, և աղտոտումները կհանգեցնեն իրական արժեքի (երբեմն ահռելի) գերագնահատմանը: Այս դեպքում ֆլյուորեսցենտների օգտագործմամբ քանակականացումը կարող է այլընտրանք լինել: Այս տեխնիկան հիմնված է լյումինեսցենտային ներկի օգտագործման վրա, որը հատուկ միանում է dsDNA-ին, միայն այն բարդույթը, որը պարունակում է նուկլեինաթթու և ներկանյութ, որը գրգռվում է լույսից, և այն հետագայում մի փոքր ավելի բարձր ալիքի լույս է արձակում: Այստեղ լյումինեսցենտային ազդանշանի ինտենսիվությունը համաչափ է ԴՆԹ-ի քանակին, իսկ կոնցենտրացիան որոշելու համար այն գնահատվում է ստանդարտ կորի հետ կապված։ Այս մեթոդի առավելությունները հիմնված են կապի առանձնահատկությունների վրա, որոնք բացառում են աղտոտման հետևանքով առաջացած արտաքին ազդեցությունները, ինչպես նաև ԴՆԹ-ի շատ ցածր կոնցենտրացիան հայտնաբերելու ունակության վրա: Ցանկացած մեթոդի համապատասխանությունը հիմնականում կախված է նմուշի կոնցենտրացիայից և մաքրությունից. Շատ դեպքերում կարող է նույնիսկ նպատակահարմար լինել զուգահեռաբար կիրառել երկու մեթոդները:
Հրապարակման ժամանակը՝ նոյ-30-2022