Krioviálokgyakran használják sejtvonalak és más kritikus biológiai anyagok kriogén tárolására folyékony nitrogénnel töltött dewarokban.

A sejtek folyékony nitrogénben való sikeres megőrzésének több szakasza van. Míg az alapelv a lassú fagyasztás, az alkalmazott pontos technika a sejttípustól és az alkalmazott krioprotektánstól függ. Számos biztonsági szempontot és bevált gyakorlatot kell figyelembe venni, amikor a cellákat ilyen alacsony hőmérsékleten tárolják.

Ennek a bejegyzésnek az a célja, hogy áttekintést adjon arról, hogyan tárolják a kriovialokat folyékony nitrogénben.

Mik azok a cryovials

A kriovialok kicsi, kupakkal ellátott fiolák, amelyeket folyékony minták rendkívül alacsony hőmérsékleten történő tárolására terveztek. Biztosítják, hogy a krioprotektánsban megőrzött sejtek ne kerüljenek közvetlenül érintkezésbe a folyékony nitrogénnel, minimalizálva a sejttörés kockázatát, miközben továbbra is élvezik a folyékony nitrogén rendkívüli hűtő hatását.

Az injekciós üvegek általában többféle méretben és kivitelben kaphatók – lehetnek belső vagy külső menetesek, lapos vagy lekerekített fenekükkel. Steril és nem steril formátumok is rendelkezésre állnak.

Ki használjaCyrovialsa sejteket folyékony nitrogénben tárolni

Számos NHS és magánlaboratórium, valamint köldökzsinórvér-bankkezelésre, hámsejtbiológiára, immunológiára és őssejtbiológiára szakosodott kutatóintézetek használnak krioviálokat a sejtek mélyhűtésére.

Az így megőrzött sejtek közé tartoznak a B- és T-sejtek, a CHO-sejtek, a vérképző ős- és az őssejtek, a hibridómák, a bélsejtek, a makrofágok, a mezenchimális ős- és az őssejtek, a monociták, a mielóma, az NK-sejtek és a pluripotens őssejtek.

A kriovialok folyékony nitrogénben való tárolásának áttekintése

A mélyhűtés olyan folyamat, amely a sejteket és más biológiai konstrukciókat nagyon alacsony hőmérsékletre való hűtéssel konzerválja. A sejtek folyékony nitrogénben évekig tárolhatók anélkül, hogy elveszítenék a sejtek életképességét. Ez az alkalmazott eljárások vázlata.

Sejt előkészítés

A minták elkészítésének pontos módszere a sejttípustól függően változik, de általában a sejteket összegyűjtik és centrifugálják, hogy sejtgazdag pelletet hozzon létre. Ezt a pelletet ezután újraszuszpendáljuk a krioprotektánssal vagy krioprezerváló közeggel kevert felülúszóban.

Krioprezervációs táptalaj

Ezt a táptalajt arra használják, hogy megőrizzék a sejteket az alacsony hőmérsékletű környezetben, aminek ki vannak téve azáltal, hogy gátolja az intra- és extracelluláris kristályok képződését, és ezáltal a sejthalált. Feladatuk, hogy biztonságos, védő környezetet biztosítsanak a sejtek és szövetek számára a fagyasztási, tárolási és felengedési folyamatok során.

A táptalajt, például a frissen fagyasztott plazmát (FFP), a heparinizált plazmolit oldatot vagy a szérummentes, állati komponensektől mentes oldatokat fagyásvédő szerekkel, például dimetil-szulfoxiddal (DMSO) vagy glicerinnel keverik.

Az újrafolyósított mintaszemcsét polipropilén krioviálisokba osztják, mint plSuzhou Ace Biomedical Company Cryogenic Storage Vials.

Fontos, hogy ne töltse túl a krioviálisokat, mert ez növeli a repedések kockázatát és a tartalom esetleges kiszabadulását (1).

Szabályozott fagyasztási sebesség

Általában lassú, szabályozott fagyasztási sebességet alkalmaznak a sejtek sikeres mélyhűtésére.

Miután a mintákat kriogén fiolákba osztották, nedves jégre vagy 4 °C-os hűtőszekrénybe helyezik, és 5 percen belül megkezdik a fagyasztási eljárást. Általánosan elmondható, hogy a cellákat percenként -1 és -3 közötti sebességgel hűtik (2). Ez egy programozható hűtővel vagy az injekciós üvegek –70°C és –90°C közötti szabályozott sebességű fagyasztóba helyezett, szigetelt dobozba helyezésével érhető el.

Átadás folyékony nitrogénre

A fagyasztott kriogén fiolákat ezután határozatlan időre folyékony nitrogén tartályba helyezik, feltéve, hogy a hőmérséklet -135 ℃ alatt van.

Ezek az ultraalacsony hőmérsékletek folyékony vagy gőzfázisú nitrogénbe merítéssel érhetők el.

Folyékony vagy gőzfázisú?

A folyékony fázisú nitrogénben történő tárolásról ismert, hogy abszolút konzisztenciával fenntartja a hideg hőmérsékletet, de gyakran nem ajánlott a következő okok miatt:

• Nagy mennyiségű (mélység) folyékony nitrogén szükségessége, ami potenciális veszélyt jelent. Az ebből eredő égési sérülések vagy fulladás valós kockázatot jelent.
• Fertőző ágensekkel, például aspergillusszal, hep B-vel és a folyékony nitrogén közegen keresztül terjedő vírusfertőzés dokumentált esetei (2,3)
• Folyékony nitrogén szivárgása az injekciós üvegekbe merülés közben. Amikor kivesszük a tárolásból és szobahőmérsékletre melegítjük, a nitrogén gyorsan kitágul. Következésképpen az injekciós üveg összetörhet, ha kiveszi a folyékony nitrogéntárolóból, ami veszélyt jelent mind a repülő törmelék, mind a tartalomnak való kitettség miatt (1, 4).

Ezen okok miatt az ultraalacsony hőmérsékletű tárolás leggyakrabban gőzfázisú nitrogénben történik. Ha a mintákat folyékony fázisban kell tárolni, speciális krioflex csövet kell használni.

A gőzfázis hátránya, hogy függőleges hőmérsékleti gradiens léphet fel, ami -135 ℃ és -190 ℃ közötti hőmérséklet-ingadozást eredményez. Ez szükségessé teszi a folyékony nitrogénszintek és a hőmérséklet-ingadozások gondos és szorgalmas ellenőrzését (5).

Sok gyártó azt javasolja, hogy a kriovialok -135 ℃-ig vagy csak gőzfázisban történő tárolásra alkalmasak.

A mélyhűtött sejtek felolvasztása

A felengedési eljárás megterhelő a fagyasztott tenyészet számára, és megfelelő kezelésre és technikára van szükség a sejtek optimális életképességének, regenerálódásának és működőképességének biztosításához. A pontos felolvasztási protokollok az adott sejttípustól függenek. A gyors felolvasztás azonban szabványosnak számít, ha:

• Csökkentse a sejtek helyreállítására gyakorolt ​​​​hatásokat
• Segítsen csökkenteni a fagyasztóközegben lévő oldott anyagok expozíciós idejét
• Minimalizálja a jég újrakristályosodása okozta károkat

A minták felolvasztására általában vízfürdőket, gyöngyfürdőket vagy speciális automatizált eszközöket használnak.

Leggyakrabban 1 sejtvonalat olvasztanak fel 1-2 percig úgy, hogy 37 ℃-os vízfürdőben óvatosan kavargatják, amíg csak egy kis jég marad az injekciós üvegben, mielőtt előmelegített tápközegben mossák.

Egyes sejtek, például az emlős embriók esetében a lassú felmelegedés elengedhetetlen a túlélésükhöz.

A sejtek készen állnak a sejttenyésztésre, a sejtizolációra, vagy haematopoietikus őssejtek esetében - életképességi vizsgálatokra, hogy garantálják a donor őssejtek integritását a mieloablatív terápia előtt.

A szokásos gyakorlat az előmosott mintából kis aliquot részeket venni a sejtszámláláshoz, hogy meghatározza a sejtkoncentrációt a tenyészetbe történő szélesztéshez. Ezután értékelheti a sejtizolációs eljárások eredményeit, és meghatározhatja a sejtek életképességét.

A krioviális állatok tárolásának legjobb gyakorlatai

A kriovialákban tárolt minták sikeres mélyhűtése a protokoll számos elemétől függ, beleértve a megfelelő tárolást és nyilvántartást.

• Ossza fel a cellákat a tárolási helyek között– Ha a térfogatok engedik, ossza fel a sejteket az injekciós üvegek között, és tárolja külön helyen, hogy csökkentse a berendezés meghibásodása miatti mintaveszteség kockázatát.
• Keresztszennyeződés elkerülése– Válasszon egyszer használatos, steril kriogén fiolákat vagy autoklávot a későbbi használat előtt
• Használjon megfelelő méretű fiolákat a sejtekhez– az injekciós üvegek 1 és 5 ml közötti térfogatúak. Kerülje az injekciós üvegek túltöltését a repedések kockázatának csökkentése érdekében.
• Válasszon belső vagy külső menetes kriogén fiolákat– Egyes egyetemek a belső menetes fiolákat ajánlják biztonsági intézkedésekre – ezek a szennyeződést is megakadályozhatják a töltés során vagy a folyékony nitrogénben tárolva.
• A szivárgás megelőzése- A szivárgás és a szennyeződés elkerülése érdekében használjon kettős befecskendezésű tömítéseket, amelyeket a csavaros kupakba vagy az O-gyűrűkbe öntöttek.
• Használjon 2D vonalkódokat és címkés fiolákat– a nyomon követhetőség biztosítása érdekében a nagy írófelületű fiolák lehetővé teszik az egyes injekciós üvegek megfelelő címkézését. A 2D vonalkódok segíthetnek a tárolás kezelésében és nyilvántartásában. A színkódolt kupakok hasznosak a könnyebb azonosítás érdekében.
• Megfelelő tárolási karbantartás- Annak érdekében, hogy a sejtek ne vesszenek el, a tárolóedényeknek folyamatosan figyelniük kell a hőmérsékletet és a folyékony nitrogénszintet. Riasztókat kell felszerelni, hogy figyelmeztessék a felhasználókat a hibákra.

Biztonsági óvintézkedések

A folyékony nitrogén bevett gyakorlattá vált a modern kutatásban, de helytelen használat esetén súlyos sérülések kockázatát hordozza magában.

Megfelelő egyéni védőfelszerelést (PPE) kell viselni, hogy minimalizálja a fagyási sérülések, égési sérülések és egyéb káros események kockázatát a folyékony nitrogén kezelése során. Viselet

• Kriogén kesztyű
• Laboratóriumi köpeny
• Ütésálló teljes arcvédő, amely a nyakat is eltakarja
• Zárt orrú cipő
• Fröccsenésálló műanyag kötény

A folyékony nitrogén hűtőket jól szellőző helyen kell elhelyezni, hogy minimalizáljuk a fulladás kockázatát – a kiszabaduló nitrogén elpárolog és kiszorítja a légköri oxigént. A nagy mennyiségű üzletekben alacsony oxigénszintű riasztórendszerrel kell rendelkezni.

A folyékony nitrogén kezelésekor ideális a párban végzett munka, és a normál munkaidőn kívüli használatát meg kell tiltani.

Krioviálok a munkafolyamat támogatására

A Suzhou Ace Biomedical cég olyan termékek széles választékát kínálja, amelyek megfelelnek a különböző típusú sejtek mélyhűtési igényeinek. A portfólió számos tubusból és steril krioviálból áll.

Krioviálisaink a következők:

• Labor csavaros kupak 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml krioviális kriogén fiolák kúpos aljú kriocső tömítéssel

  ● 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml specifikáció, szoknyával vagy szoknya nélkül
  ● Kúpos vagy önálló kivitel, steril vagy nem steril egyaránt kapható
  ● A csavaros kupakú csövek orvosi minőségű polipropilénből készülnek
  ● A PP kriotube üvegek többször is lefagyaszthatók és felolvaszthatók
  ●A külső kupak kialakítása csökkentheti a szennyeződés valószínűségét a mintakezelés során.
  ● Csavaros kupakú kriogén csövek Univerzális csavarmenet a használatra
  ● A csövek a legtöbb általános rotorhoz illeszkednek
  ● A kriogén csöves O-gyűrűs csövek szabványos 1 és 2 hüvelykes, 48 ​​üreges, 81 üreges, 96 üreges és 100 üreges fagyasztódobozokhoz illeszkednek
  ● 121°C-ig autoklávozható és -86°C-ig fagyasztható

  RÉSZSZÁM	ANYAG	KÖTET	SAPKASZÍN	PCS/TÁSKA	TASÁK/TOK
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Fekete, Sárga, Kék, Piros, Lila, Fehér	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Fekete, Sárga, Kék, Piros, Lila, Fehér	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Fekete, Sárga, Kék, Piros, Lila, Fehér	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Fekete, Sárga, Kék, Piros, Lila, Fehér	500	10