KrioviálisokÁltalában a sejtvonalak és más kritikus biológiai anyagok kriogén tárolására használják, folyékony nitrogénnel töltve.

Számos szakaszban vesznek részt a sejtek sikeres megőrzésében a folyékony nitrogénben. Noha az alapelv lassú fagy, az alkalmazott pontos technika az alkalmazott sejttípustól és a krioprotektánstól függ. Számos biztonsági megfontolás és bevált gyakorlat, amelyeket figyelembe kell venni a cellák ilyen alacsony hőmérsékleten történő tárolásakor.

Ennek a bejegyzésnek az a célja, hogy áttekintést adjon a krioviálisok tárolásáról a folyékony nitrogénben.

Mik azok a kriovialisok

A kriovialisok kicsi, korlátozott injekciós üvegek, amelyeket a folyékony minták rendkívül alacsony hőmérsékleten történő tárolására terveztek. Gondoskodnak arról, hogy a krioprotektánsban megőrzött sejtek ne kerüljenek közvetlen érintkezésbe a folyékony nitrogénnel, minimalizálva a sejtek töréseinek kockázatát, miközben továbbra is részesülnek a folyékony nitrogén szélsőséges hűtési hatásából.

Az üvegek általában számos kötetben és mintában kaphatók - ezek belsőleg vagy külsőleg lehetnek lapos vagy lekerekített fenekével. Steril és nem steril formátumok is rendelkezésre állnak.

Ki használjaCirovialisokA sejtek folyékony nitrogénben történő tárolására

Az NHS és a magán laboratóriumok, valamint a kábelvér -banki tevékenységekre, az epiteliális sejtbiológiára, az immunológiára és az őssejt -biológiára szakosodott kutatóintézetek kriovialumokat használnak a hidegsejtekhez.

Az ilyen módon megőrzött sejtek közé tartozik a B és T -sejtek, a CHO -sejtek, a hematopoietikus szár és a progenitor sejtek, a hibridómák, a bélsejtek, a makrofágok, a mezenchimális szár és a progenitor sejtek, a monociták, a mielóma, az NK sejtek és a pluripotens őssejtek.

Áttekintés arról, hogyan lehet tárolni a krioviálisokat folyékony nitrogénben

A hidegkonzerváció egy olyan folyamat, amely megőrzi a sejteket és más biológiai konstrukciókat azáltal, hogy nagyon alacsony hőmérsékletre hűti őket. A sejteket évekig folyékony nitrogénben lehet tárolni a sejtek életképességének elvesztése nélkül. Ez az alkalmazott eljárások körvonala.

Sejtkészítés

A minták előkészítésének pontos módszere a sejttípustól függően változhat, de általában a sejteket összegyűjtik és centrifugálják egy sejtben gazdag pellet kialakításához. Ezt a pelletet ezután újraszuszpendálják a felülúszóban krioprotektánssal vagy egy hidegkonzervációs közeggel keverve.

Hidegkonzervációs közeg

Ezt a tápközeget alkalmazzák a sejtek megőrzésére az alacsony hőmérsékletű környezetben, amelyet az intra- és extracelluláris kristályok képződésének gátlásával és ennélfogva a sejthalál gátlásával gátolják. Szerepük az, hogy biztonságos, védő környezetet biztosítsanak a sejtek és szövetek számára a fagyasztási, tárolási és felolvasztási folyamatok során.

Egy közeg, például friss fagyasztott plazma (FFP), heparinizált plazma-oldat vagy szérummentes, állati komponens-mentes oldatokat keverünk krioprotektánsokkal, például dimetil-szulfoxiddal (DMSO) vagy glicerinnel.

Az újra-liquified mintapellet alikvotálódik polipropilén-kriovialumokkáSuzhou Ace Biomedical Company kriogén tároló fiolák.

Fontos, hogy ne töltse ki a krioviálisokat, mivel ez növeli a repedés kockázatát és a tartalom lehetséges felszabadulását (1).

Ellenőrzött fagyasztási sebesség

Általában lassan ellenőrzött fagyasztási sebességet alkalmazunk a sejtek sikeres hidegkonzervációjához.

Miután a mintákat kriogén fiolákba aliquotizálják, nedves jégre vagy 4 ℃ hűtőszekrénybe helyezik, és a fagyasztási eljárást 5 percen belül elindítják. Általános útmutatóként a sejteket -1–3 / perc (2) sebességgel lehűtjük. Ezt programozható hűtővel vagy injekciós dobozba helyezve egy –70 ° C -os - 90 ° C -os vezérelt fagyasztóba helyezve egy szigetelt dobozba helyezve.

Transzfer folyékony nitrogénbe

A fagyasztott kriogén fiolákat ezután egy folyékony nitrogéntartályba továbbítják határozatlan időre, biztosítva -135 ℃ -nél kisebb hőmérsékletet.

Ezeket az ultra alacsony hőmérsékleteket a folyadék vagy gőzfázisú nitrogénbe merítéssel lehet elérni.

Folyékony vagy gőzfázis?

A folyadékfázisú nitrogénben történő tárolásról ismert, hogy abszolút konzisztenciával fenntartja a hideghőmérsékletet, de gyakran a következő okokból nem ajánlott:

• A folyékony nitrogén nagy mennyiségének (mélységének) szükségessége, amely potenciális veszélyt jelent. Az égési sérülések vagy a fulladás ennek miatt valódi kockázat.
• A fertőző ágensek, például Aspergillus, Hep B és a vírusos terjedés dokumentált esetei a folyékony nitrogén tápközegen keresztül (2,3)
• A folyékony nitrogén potenciálja az injekciós fiolákba merülés során. Ha eltávolítják a tárolást, és szobahőmérsékletre melegítik, a nitrogén gyorsan bővül. Következésképpen az injekciós üveg összetörhet, ha eltávolítják a folyékony nitrogén -tárolásból, és veszélyt jelentenek mind a repülő törmelékből, mind a tartalom kitettségéből (1, 4).

Ezen okok miatt az ultra-alacsony hőmérsékleti tárolás leggyakrabban a gőzfázisú nitrogénben van. Amikor a mintákat a folyékony fázisban kell tárolni, speciális Cryoflex csöveket kell használni.

A gőzfázis hátránya, hogy függőleges hőmérsékleti gradiens előfordulhat, ami -135 ℃ és -190 ℃ között hőmérsékleti ingadozásokat eredményezhet. Ehhez szükség van a folyékony nitrogénszintek és a hőmérsékleti variációk gondos és szorgalmas megfigyelésére (5).

Számos gyártó azt javasolja, hogy a kriovialisok alkalmasak -135 ℃ -ig vagy csak gőzfázisban történő használatra.

Megolvasztja a hidegkonzervált sejteket

A kiolvadási eljárás stresszes a fagyasztott kultúra számára, és a megfelelő kezelési és technika szükséges a sejtek optimális életképességének, helyreállításának és funkcionalitásának biztosítása érdekében. A pontos kiolvadási protokollok az egyes sejttípusoktól függnek. A gyors felolvasztást azonban a következőknek tekintik:

• Csökkentse a sejtek visszanyerésére gyakorolt ​​bármilyen hatást
• Segítsen csökkenteni az oldott anyagok expozíciós idejét a fagyasztó közegben
• Minimalizálja az esetleges károkat jégkristályosítással

A minták felolvasztására általában vízfürdők, gyöngyfürdők vagy speciális automatizált műszerek használják.

A leggyakrabban 1 cellás vonalat egyszerre 1-2 percig felolvasztanak, óvatosan kavarogva egy 37 ℃ vízfürdőben, amíg csak egy kis jég marad az üvegben, mielőtt egy előremált táptalajban mossák őket.

Egyes sejtek, például emlős embriók esetében a lassú felmelegedés elengedhetetlen a túléléshez.

A sejtek készen állnak a sejttenyészetre, a sejtek izolálására vagy a hematopoietikus őssejtek esetében - életképességi vizsgálatok, hogy garantálják a donor őssejtek integritását a mieloablációs terápia előtt.

Normál gyakorlat, hogy a sejtszám elvégzéséhez használt előzetes mintavétel kis aliquotjait vesszük figyelembe a tenyésztéshez szükséges sejtkoncentrációk meghatározásához. Ezután felmérheti a sejtek izolálási eljárásainak eredményeit és meghatározhatja a sejtek életképességét.

A krioviálisok tárolására szolgáló bevált gyakorlatok

A krioviálisokban tárolt minták sikeres hidegkonzerválása a protokoll számos elemétől függ, beleértve a megfelelő tárolást és a nyilvántartást.

• Osztja a cellákat a tárolási helyek között- Ha a mennyiségek lehetővé teszik, akkor osztja fel a cellákat az üvegek között, és külön helyeken tárolja azokat a berendezés meghibásodása miatti minta elvesztésének kockázatának csökkentése érdekében.
• Megakadályozzák a keresztszennyeződést-Válassza ki az egyszer használatos steril kriogén fiolákat vagy autoklávot a későbbi felhasználás előtt
• Használjon megfelelő méretű fiolákat a celláihoz- Az injekciós üvegek számos térfogatban vannak 1 és 5 ml között. Kerülje a túltöltési fiolák túltöltését a repedés kockázatának csökkentése érdekében.
• Válassza ki a belső vagy külsőleg menetes kriogén fiolákat- Néhány egyetem ajánlja a belsőleg menetes fiolákat biztonsági intézkedésekhez - ezek megakadályozhatják a szennyeződést a töltés során vagy a folyékony nitrogénben tárolva.
• Megakadályozza a szivárgást-A szivárgás és a szennyeződés megakadályozása érdekében használjon a csavarkaparba vagy az O-gyűrűkbe öntött két-injektált tömítéseket.
• Használjon 2D vonalkódokat és címkézési fiolákat- A nyomon követhetőség biztosítása érdekében a nagy írási területekkel rendelkező fiolák lehetővé teszik az egyes fiolák megfelelő címkézését. A 2D vonalkódok segíthetnek a tárolás kezelésében és a nyilvántartásban. A színkódolt kupakok hasznosak a könnyebb azonosításhoz.
• Megfelelő tárolási karbantartás- Annak biztosítása érdekében, hogy a sejtek ne veszjenek el, a tárolóedényeknek folyamatosan figyelemmel kell kísérniük a hőmérsékletet és a folyékony nitrogénszintet. A riasztásokat fel kell szerelni, hogy figyelmeztesse a felhasználókat a hibákra.

Biztonsági óvintézkedések

A folyékony nitrogén a modern kutatásban gyakori gyakorlatává vált, de helytelenül használja a súlyos sérülések kockázatát.

Megfelelő személyi védőeszközöket (PPE) kell viselni, hogy minimalizálják a fagyás, égési sérülések és egyéb káros események kockázatát a folyékony nitrogén kezelése során. Viselet

• Kriogén kesztyű
• Laboratóriumi kabát
• Ütésálló, teljes arcpajzs, amely szintén lefedi a nyakát
• Zárt lábujj cipő
• Splashprofof műanyag kötény

A folyékony nitrogén hűtőszekrényeket jól szellőztetett területeken kell elhelyezni, hogy minimalizálják a fulladás kockázatát-a menekült nitrogén elpárolog, és elmozdítja a légköri oxigént. A nagy mennyiségű üzleteknek alacsony oxigén riasztórendszerekkel kell rendelkezniük.

A folyékony nitrogén kezelésekor párban való munka ideális, és a normál munkaidőn kívüli használatát tiltani kell.

Cryovials a munkafolyamat támogatására

A Suzhou Ace Biomedical Company széles választékot kínál, amelyek megfelelnek az Ön számára a különféle típusú sejtek számára. A portfólió számos csővel, valamint sok steril kriovialumot tartalmaz.

A krioviálisok a következők:

• Laboratóriumi csavaros kupak 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml krioviális kriogén fiolák kúpos kriotube tömítéssel

  ● 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml specifikáció, szoknya vagy szoknya nélkül
  ● Kúpos vagy önálló kialakítás, steril vagy nem steril is rendelkezésre áll
  ● A csavaros sapkacsövek orvosi minőségű polipropilénből készülnek
  ● A PP kriotube -fiolák többször fagyaszthatók és felolvaszthatók
  ● A külső kupak kialakítása csökkentheti a szennyeződés valószínűségét a minta kezelése során.
  ● Csavaros sapka kriogén csövek univerzális csavaros szálak felhasználáshoz
  ● A csövek a leggyakoribb rotorokhoz illenek
  ● kriogén cső Az O-gyűrűs csövek illeszkednek a standard 1 hüvelykes és 2 hüvelykes, 48Well, 81Well ， 96WELL és 100WELL fagyasztó dobozokhoz
  ● Autoklaválható 121 ° C -ra és fagyható -86 ° C -ra fagyható

  Részben	ANYAG	KÖTET	SAPKASZÍN	PCS/TÁSKA	Táskák/tok
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Fekete, sárga, kék, piros, lila, fehér	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Fekete, sárga, kék, piros, lila, fehér	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Fekete, sárga, kék, piros, lila, fehér	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Fekete, sárga, kék, piros, lila, fehér	500	10