A folyamatok szabványosítása magában foglalja azok optimalizálását, majd az azt követő létrehozást és harmonizációt, amely lehetővé teszi a hosszú távú – felhasználótól független – optimális teljesítményt. A szabványosítás biztosítja a kiváló minőségű eredményeket, valamint azok reprodukálhatóságát és összehasonlíthatóságát.
A (klasszikus) PCR célja megbízható és reprodukálható eredmény létrehozása. Bizonyos alkalmazásoknál a hozam aPCR termékis releváns. Ezeknél a reakcióknál ügyelni kell arra, hogy a minták ne sérüljenek, és hogy a PCR munkafolyamata stabil maradjon. Ez konkrétan azt jelenti, hogy minimálisra csökkentik az olyan szennyeződések bejutását, amelyek fals pozitív vagy hamis negatív eredményekhez vezethetnek, vagy akár gátolhatják a PCR-reakciót. Ezenkívül a reakciókörülményeknek lehetőleg azonosnak kell lenniük minden egyes mintánál egy futtatáson belül, és átvihetőknek kell lenniük a következő reakciókra (ugyanaz a módszer). Ez a reakciók összetételére, valamint a ciklus hőmérséklet-szabályozásának típusára vonatkozik. A felhasználói hibákat természetesen lehetőleg kerülni kell.
Az alábbiakban bemutatjuk azokat a kihívásokat, amelyekkel a PCR előkészítése és lefutása során szembesülünk – és a PCR-munkafolyamatok szabványosításához használt műszerek és fogyóeszközök tekintetében meglévő megoldási megközelítéseket.
Reakció előkészítés
A reakciókomponensek PCR-edényekbe, illetve lemezekbe való adagolása több kihívást is magában foglal, amelyeket le kell küzdeni:
Reakciókörülmények
Az egyes komponensek pontos és precíz adagolása elengedhetetlen, ha a lehető legazonosabb reakciókörülményekre törekszünk. A jó pipettázási technika mellett kritikus a megfelelő eszköz kiválasztása. A PCR mesterkeverékek gyakran tartalmaznak olyan anyagokat, amelyek növelik a viszkozitást vagy habot képeznek. A pipettázási folyamat során ezek jelentős nedvesedéshez vezetnekpipettahegyek, ezáltal csökken a pipettázás pontossága. Közvetlen adagolórendszerek vagy alternatív pipettahegyek használata, amelyek kevésbé hajlamosak a nedvesítésre, javíthatja a pipettázási folyamat pontosságát.
Szennyeződések
Az adagolási folyamat során aeroszolok keletkeznek, amelyek, ha hagyják, hogy elérjék a pipetta belsejét, potenciálisan egy másik mintát szennyezhetnek be a következő pipettázási lépés során. Ez szűrőhegyekkel vagy közvetlen elmozdulású rendszerekkel megelőzhető.
Fogyóeszközök, mint pltippeket, a PCR munkafolyamatban használt edények és lemezek nem tartalmazhatnak olyan anyagokat, amelyek veszélyeztetik a mintát vagy meghamisítják az eredményt. Ide tartoznak a DNS, a DNázok, az RNázok és a PCR-inhibitorok, valamint olyan komponensek, amelyek potenciálisan kimosódhatnak az anyagból a reakció során – ezek a kioldható anyagok.
Felhasználói hiba
Minél több mintát dolgoznak fel, annál nagyobb a hibakockázat. Könnyen előfordulhat, hogy rossz edénybe vagy rossz lyukba pipettáznak egy mintát. Ez a kockázat jelentősen csökkenthető a kutak jól felismerhető jelölésével. Az adagolási lépések automatizálása révén az „emberi tényező”, azaz a hibák és a felhasználó által okozott eltérések minimálisra csökkennek, ezzel is növelve a reprodukálhatóságot, különösen kis reakciótérfogat esetén. Ehhez megfelelő méretstabilitású lemezeket kell alkalmazni egy munkaállomáson. A csatolt vonalkódok további gépi olvashatóságot biztosítanak, ami leegyszerűsíti a mintakövetést a teljes folyamat során.
A termocikler programozása
Egy hangszer programozása időigényesnek és hibásnak is bizonyulhat. A különböző PCR termikus ciklus funkciói együtt működnek, hogy leegyszerűsítsék ezt a folyamatlépést, és ami a legfontosabb, biztonságossá tegyék:
Az egyszerű kezelés és a jó felhasználói útmutatás a hatékony programozás alapja. Erre az alapra építve a jelszóval védett felhasználói adminisztráció megakadályozza, hogy más felhasználók módosítsák a saját programjainkat. Ha több (azonos típusú) ciklus van használatban, akkor előnyös, ha egy program USB-n vagy csatlakozáson keresztül közvetlenül átvihető egyik hangszerről a másikra. A számítógépes szoftver lehetővé teszi a programok, felhasználói jogok és dokumentumok központi és biztonságos kezelését a számítógépen.
PCR futtatás
A futtatás során a DNS-t a reakcióedényben amplifikálják, ahol minden mintát azonos, konzisztens reakciókörülményeknek kell alávetni. A folyamat szempontjából a következő szempontok relevánsak:
Hőmérséklet szabályozás
A hőmérséklet-szabályozás kiváló pontossága és a ciklusblokk homogenitása az alapja az összes minta egyenletes hőmérséklet-kondicionálásának. A fűtő- és hűtőelemek (peltier-elemek) magas minősége, valamint a blokkhoz való kapcsolódás módja azok a döntő tényezők, amelyek meghatározzák az „élhatás” néven ismert hőmérsékleti eltérések kockázatát.
Párolgás
Az egyes reakciókomponensek koncentrációja a reakció során a párolgás miatt nem változhat. Ellenkező esetben lehetséges, hogy nagyon kevésPCR terméklétre lehet hozni, vagy egyáltalán nem. Ezért rendkívül fontos a párolgás minimalizálása a biztonságos tömítés biztosításával. Ebben az esetben a termocikler fűtött fedele és az edény tömítése kéz a kézben működik. Különféle tömítési lehetőségek állnak rendelkezésrePCR lemezek (link: Pecsételő cikk), ahol a legjobb tömítés a hőhegesztéssel érhető el. Más záróelemek is megfelelőek lehetnek, amennyiben a kerékpárfedél érintkezési nyomása a kiválasztott tömítéshez állítható.
A folyamatok szabványosítása a pontos és reprodukálható eredmények hosszú távú megőrzése érdekében működik. Ez magában foglalja a berendezés rendszeres karbantartását annak érdekében, hogy mindig jó állapotban legyen. Minden fogyóeszköznek állandóan jó minőségűnek kell lennie az összes gyártott tételben, és garantálni kell megbízható elérhetőségüket.
Feladás időpontja: 2022.11.29