Bevezetés
Mi a nukleinsav extrahálás?
A legegyszerűbb szempontból a nukleinsav -extrahálás az RNS és/vagy a DNS eltávolítása a mintából, és az összes felesleg, amelyre nem szükséges. Az extrahálás folyamata elkülöníti a nukleinsavakat a mintából, és koncentrált eluátum formájában adja meg őket, hígítóktól és szennyeződésektől mentes, amelyek befolyásolhatják a downstream alkalmazásokat.
Nukleinsav -extrahálás alkalmazása
A tisztított nukleinsavakat számos különféle alkalmazásban használják, több különböző iparágon keresztül. Az egészségügyi ellátás talán az a terület, ahol a legtöbbet használják, tisztított RNS -t és DNS -t, különféle tesztelési célokhoz szükségesek.
A nukleinsav -extrakció alkalmazása az egészségügyi ellátásban a következők:
- Következő generációs szekvenálás (NGS)
- Amplifikáció-alapú SNP genotípus -ítés
- tömb alapú genotipizálás
- Restrikciós enzim emésztés
- Annak elemzése a módosító enzimek felhasználásával (pl. Ligáció és klónozás)
Vannak más területek is az egészségügyi ellátáson túl, ahol nukleinsav -extrakciót használnak, ideértve, de nem kizárólag az apasági vizsgálatot, a kriminalisztikát és a genomikát.
A nukleinsav extrahálásának rövid története
DNS -extrakcióHosszú utat mutat be, amikor az első ismert izolációt egy Friedrich Miescher nevű svájci orvos hajtotta végre 1869 -ben. Miescher azt remélte, hogy megoldja az élet alapelveit a sejtek kémiai összetételének meghatározásával. Miután a limfocitákkal kudarcot vallott, képes volt nyers DNS -csapadékot szerezni a leukocitákból, amelyeket a PUS -ban találtak az eldobott kötszereken. Ezt úgy tette, hogy savat ad, majd lúg a sejthez, hogy elhagyja a sejt citoplazmáját, majd kifejlesztett egy protokollt a DNS elválasztására a többi fehérjől.
Miescher úttörő kutatása után sok más tudós folytatta a DNS elkülönítésére és megtisztítására szolgáló technikák fejlesztését és fejlesztését. Edwin Joseph Cohn, a fehérjetudós számos technikát fejlesztett ki a fehérje tisztítására a második világháború alatt. Ő volt a felelős a vérplazma szérumalbumin frakciójának izolálásáért, amely fontos az erek ozmotikus nyomásának fenntartásában. Ez döntő jelentőségű volt a katonák életben tartása érdekében.
1953 -ban Francis Crick, valamint Rosalind Franklin és James Watson, meghatározta a DNS szerkezetét, megmutatva, hogy két nukleinsav -nukleotidok hosszú láncaiból áll. Ez az áttöréses felfedezés előkészítette az utat Meselson és Stahl számára, akik képesek voltak kidolgozni egy sűrűségű gradiens centrifugációs protokollt a DNS izolálására az E. coli baktériumokból, mivel az 1958-as kísérlet során kimutatták a DNS félig konzervatív replikációját.
Nukleinsav -extrahálás technikái
Melyek a DNS -extrakció 4 stádiuma?
Az összes extrakciós módszer ugyanolyan alapvető lépésekre fordítja.
Sejtmegszakítás- Ez a stádium, más néven sejtlízis, magában foglalja a sejtfal és/vagy a sejtmembrán lebontását annak érdekében, hogy felszabaduljon az érdeklődésre számot tartó nukleinsavakat tartalmazó intracelluláris folyadékok.
A nem kívánt törmelék eltávolítása. Ide tartoznak a membrán lipidek, fehérjék és más nem kívánt nukleinsavak, amelyek zavarhatják a downstream alkalmazásokat.
Elkülönítés. Számos különféle módszer létezik az érdeklődésre számot tartó nukleinsavak elkülönítésére az Ön által létrehozott tisztított lizátumtól, amely két fő kategória között esik: oldat -alapú vagy szilárd állapot (lásd a következő részt).
Koncentráció. Miután a nukleinsavakat elkülönítették az összes többi szennyező anyagból és hígítóból, egy erősen koncentrált eluate-ban mutatják be őket.
A kétféle extrakció
Kétféle nukleinsav -extrakció - oldat alapú módszerek és szilárdtest -módszerek létezik. Az oldat -alapú módszert kémiai extrakciós módszernek is nevezik, mivel ez magában foglalja a cella lebontására és a nukleikus anyag elérésére szolgáló vegyi anyagok használatát. Ez akár szerves vegyületeket, például fenolot és kloroformot használhat, vagy kevésbé káros, és ezért inkább ajánlott szervetlen vegyületek, például proteináz K vagy szilikagél.
A sejtek lebontására szolgáló különféle kémiai extrakciós módszerek példái a következők:
- A membrán ozmotikus törése
- A sejtfal enzimatikus emésztése
- A membrán szolubilizálása
- mosószerekkel
- lúgos kezeléssel
A szilárdtest technikák, más néven mechanikai módszerek, magában foglalják annak kiaknázását, hogy a DNS hogyan működik kölcsönhatásba egy szilárd szubsztráttal. Olyan gyöngy vagy molekula kiválasztásával, amelyre a DNS kötődik, de az analit nem lesz, akkor a kettőt elválaszthatja. Példák a szilárd fázisú extrakciós technikákra, ideértve a szilícium-dioxid és a mágneses gyöngyök használatát.
Magyarázott mágneses gyöngy extrakció
A mágneses gyöngy extrahálási módszer
A mágneses gyöngyök felhasználásával történő extrakciós lehetőséget először Trevor Hawkins által benyújtott amerikai szabadalomban elismerték a Whitehead Institute Kutatóintézet számára. Ez a szabadalom elismerte, hogy lehetséges a genetikai anyag kinyerése azáltal, hogy kötődik egy szilárd tartóhordozóhoz, amely mágneses gyöngy lehet. Az alapelv az, hogy egy erősen funkcionált mágneses gyöngyöt használ, amelyre a genetikai anyag kötődik, amelyre elválasztható a felülúszótól, mágneses erő alkalmazásával a mintát tartó edény külső oldalára.
Miért használja a mágneses gyöngy extrahálást?
A mágneses gyöngyök extrakciós technológiája egyre inkább elterjedt, mivel a gyors és hatékony extrakciós eljárások számára fennáll. Az utóbbi időben a jól funkcionált mágneses gyöngyök fejlesztései voltak megfelelő pufferrendszerekkel, amelyek lehetővé tették a nukleinsav-extrakció és a munkafolyamat automatizálását, amely nagyon erőforrás-fény és költséghatékony. Ezenkívül a mágneses gyöngy extrakciós módszerek nem foglalják magukban a centrifugálási lépéseket, amelyek olyan nyíróerőket okozhatnak, amelyek hosszabb DNS -darabokat szakítanak meg. Ez azt jelenti, hogy a hosszabb DNS -szálok érintetlenek maradnak, ami fontos a genomikai tesztelés során.
A postai idő: november-25-2022