Bevezetés
Mi az a nukleinsav extrakció?
A legegyszerűbben fogalmazva, a nukleinsav-kivonás az RNS és/vagy DNS eltávolítása a mintából, valamint minden felesleges mennyiség eltávolítása. Az extrakciós folyamat a nukleinsavakat izolálja a mintából, és koncentrált eluátum formájában kapja meg azokat, hígítóktól és szennyeződésektől mentesen, amelyek befolyásolhatják a későbbi alkalmazásokat.
A nukleinsav extrakció alkalmazásai
A tisztított nukleinsavakat számos különböző alkalmazásban használják, számos különböző iparágban. Talán az egészségügy az a terület, ahol a legtöbbet használják, mivel tisztított RNS-re és DNS-re van szükség számos különböző vizsgálati célra.
A nukleinsav extrakció alkalmazásai az egészségügyben a következők:
- Következő generációs szekvenálás (NGS)
- Erősítés alapú SNP genotipizálás
- Tömb alapú genotipizálás
- Restrikciós enzimemésztés
- Elemzések módosító enzimekkel (pl. ligálás és klónozás)
Az egészségügyön kívül más területeken is alkalmazzák a nukleinsav-kivonást, ideértve, de nem kizárólagosan az apasági vizsgálatot, a törvényszéki elemzést és a genomikát.
A nukleinsav-kivonás rövid története
DNS kivonásHosszú időre nyúlik vissza, az első ismert izolálást egy Friedrich Miescher nevű svájci orvos végezte 1869-ben. Miescher azt remélte, hogy a sejtek kémiai összetételének meghatározásával megoldja az élet alapvető elveit. Miután kudarcot vallott a limfocitáknál, nyers DNS-csapadékot tudott előállítani az eldobott kötszereken gennyben talált leukocitákból. Ezt úgy tette, hogy savat, majd lúgot adott a sejthez, hogy elhagyja a sejt citoplazmáját, majd kidolgozott egy protokollt a DNS elválasztására a többi fehérjétől.
Miescher úttörő kutatásait követően sok más tudós is továbbfejlesztette és kifejlesztette a DNS izolálására és tisztítására szolgáló technikákat. Edwin Joseph Cohn fehérjetudós számos technikát fejlesztett ki a fehérjetisztításra a második világháború alatt. Ő volt a felelős a vérplazma szérum albumin frakciójának izolálásáért, amely fontos az erek ozmotikus nyomásának fenntartásában. Ez döntő volt a katonák életben tartásához.
1953-ban Francis Crick, Rosalind Franklinnel és James Watsonnal együtt meghatározta a DNS szerkezetét, kimutatva, hogy az két hosszú nukleinsav-nukleotidláncból áll. Ez az áttörést jelentő felfedezés megnyitotta az utat Meselson és Stahl számára, akik egy sűrűséggradiens centrifugálási protokollt tudtak kidolgozni a DNS izolálására az E. coli baktériumokból, mivel 1958-as kísérletük során kimutatták a DNS félig konzervatív replikációját.
A nukleinsav-kivonás technikái
Mi a DNS-kivonás 4 szakasza?
Minden extrakciós módszer ugyanazon alapvető lépéseken alapul.
Cell Disruption. Ez a szakasz, más néven sejtlízis, magában foglalja a sejtfal és/vagy a sejtmembrán lebontását annak érdekében, hogy felszabaduljanak a kérdéses nukleinsavakat tartalmazó intracelluláris folyadékok.
Nem kívánt törmelék eltávolítása. Ide tartoznak a membránlipidek, fehérjék és más nem kívánt nukleinsavak, amelyek megzavarhatják a későbbi alkalmazásokat.
Elkülönítés. Számos különböző módszer létezik a kérdéses nukleinsavak izolálására az Ön által létrehozott tisztított lizátumból, amelyek két fő kategóriába sorolhatók: oldatalapú vagy szilárd állapotú (lásd a következő részt).
Koncentráció. Miután a nukleinsavakat izoláltuk az összes többi szennyezőtől és hígítószertől, nagy töménységű eluátumban kerülnek bemutatásra.
A kivonás két típusa
A nukleinsav extrakciónak két típusa létezik: oldat alapú és szilárd fázisú módszerek. Az oldat alapú módszert kémiai extrakciós módszernek is nevezik, mivel vegyszereket használnak a sejt lebontására és a nukleinsavhoz való hozzáférésre. Ez történhet szerves vegyületek, például fenol és kloroform, vagy kevésbé káros és ezért inkább ajánlott szervetlen vegyületek, például Proteinase K vagy szilikagél felhasználásával.
Példák a sejt lebontására szolgáló különféle kémiai extrakciós módszerekre:
- A membrán ozmotikus megrepedése
- A sejtfal enzimatikus emésztése
- A membrán oldódása
- Mosószerekkel
- Lúgos kezeléssel
A szilárdtest-technikák, más néven mechanikai módszerek, magukban foglalják a DNS és a szilárd szubsztrát közötti kölcsönhatás kiaknázását. Ha kiválasztunk egy gyöngyöt vagy molekulát, amelyhez a DNS kötődni fog, de az analit nem, akkor a kettő szétválasztható. Példák szilárd fázisú extrakciós technikákra, beleértve a szilícium-dioxid és a mágneses gyöngyök használatát.
Mágneses gyöngy extrakció magyarázata
A mágneses gyöngy extrakciós módszere
A mágneses gyöngyökkel történő extrakció lehetőségét először Trevor Hawkins, a Whitehead Institute kutatóintézet számára benyújtott amerikai szabadalomban ismerték fel. Ez a szabadalom elismerte, hogy lehetséges a genetikai anyag kinyerése szilárd hordozó hordozóhoz való kötésével, amely lehet mágneses gyöngy. Az elv az, hogy egy erősen funkcionalizált mágneses gyöngyöt kell használni, amelyhez a genetikai anyag meg fog kötni, majd a mintát tartó edény külső oldalára mágneses erővel el lehet választani a felülúszótól.
Miért használjunk mágneses gyöngy extrakciót?
A mágneses gyöngy extrakciós technológia egyre elterjedtebbé válik, a gyors és hatékony extrakciós eljárásokban rejlő lehetőségek miatt. Az utóbbi időben nagymértékben funkcionalizált mágneses gyöngyöket fejlesztettek ki megfelelő pufferrendszerekkel, amelyek lehetővé tették a nukleinsav-kivonás automatizálását és egy olyan munkafolyamatot, amely nagyon erőforrás-könnyű és költséghatékony. Ezenkívül a mágneses gyöngyök extrakciós módszerei nem tartalmaznak olyan centrifugálási lépéseket, amelyek nyíróerőket okozhatnak, amelyek hosszabb DNS-darabokat törnek fel. Ez azt jelenti, hogy a DNS hosszabb szálai érintetlenek maradnak, ami fontos a genomikai vizsgálatok során.
Feladás időpontja: 2022. november 25