Menm si nan teyori, yon molekil nan modèl la ta dwe ase, konsiderableman pi gwo kantite ADN yo tipikman itilize pou yon PCR klasik, pou egzanp, jiska 1 µg nan ADN mamifè jenomik ak tankou ti kòm 1 pg nan ADN plasmid. Kantite lajan an pi bon depann lajman sou kantite kopi sekans lan sib, menm jan tou sou konpleksite li yo.
Si yo itilize anpil ti modèl, yo pral bezwen yon ogmantasyon korespondan nan kantite sik anplifikasyon yo bezwen pou jwenn yon kantite ase pwodwi. Yon polimeraz TAQ ki itilize pou pifò eksperyans PCR pa prezante yon fonksyon koreksyon (3′-5 ′ aktivite exonuclease); Se konsa, erè ki rive pandan anplifikasyon pa ka korije. Pi wo a ki kantite sik, plis répandus anplifikasyon an nan pwodwi defekte yo pral. Si, nan lòt men an, kantite lajan an nan modèl se twò wo, pwobabilite ki genyen pou prime rkwir nan lòt (pa yon santèn pousan flater) sekans, osi byen ke fòmasyon nan Dimers Jadendanfan, ap ogmante, ki pral rezilta nan anplifikasyon an nan pa pwodwi. Nan anpil ka, ADN izole nan kilti selil yo oswa nan mikwo -òganis ak imedyatman itilize kòm yon modèl PCR. Apre pirifye, li nesesè pou detèmine konsantrasyon ADN lan pou kapab defini volim ki nesesè pou konfigirasyon PCR la. Pandan ke elèktroforèz jèl agarose ka sèvi bay yon estimasyon, metòd sa a se lwen soti nan egzat. UV-vis spektrofotometri te etabli kòm estanda an lò pou quantification nan asid nikleyik; Sa a metòd dirèk ak Se poutèt sa fasil ak rapid mezi absorption nan echantiyon an nan 260 nm, ak konsantrasyon se kalkile avèk èd nan yon faktè konvèsyon.
Si konsantrasyon ADN lan trè ba, sepandan (<1 µg/mL dsDNA), oswa si li kontamine ak sibstans ki tou absòbe nan seri a 260 nm (egzanp RNA, pwoteyin, sèl), metòd sa a pral rive nan limit li yo. Nan ka konsantrasyon ki ba anpil, lekti yo pral byento vin twò kòrèk yo dwe nan itilize, ak kontaminasyon ap mennen nan (pafwa menmen) surèstimasyon nan valè aktyèl la. Nan ka sa a, quantification lè l sèvi avèk fluoresans ka prezante yon altènatif. Se teknik sa a ki baze sou itilize nan yon lank fliyoresan ki mare espesyalman nan dsDNA sèlman konplèks la comprenant asid nikleyik ak lank eksite pa limyè a, epi li pral imedyatman emèt limyè nan yon longèdonn yon ti kras pi wo. Isit la, entansite a nan siyal la fliyoresan se pwopòsyonèl ak kantite lajan an nan ADN, ak pou detèmine konsantrasyon an li se evalye an relasyon ak yon koub estanda. Avantaj ki genyen nan metòd sa a repoze sou espesifik nan kosyon an, ki eksklizyon enfliyans yo ekstèn prezante pa kontaminasyon, osi byen ke sou kapasite a ki kapab lakòz yo detekte konsantrasyon ki ba anpil nan ADN. Konvnab nan swa metòd depann sitou sou konsantrasyon echantiyon ak pite; Nan anpil ka li ka menm rekòmande pou aplike tou de metòd nan paralèl.
Post tan: Nov-30-2022