Menm si nan teyori, yon sèl molekil nan modèl la ta ase, konsiderableman pi gwo kantite ADN yo tipikman itilize pou yon PCR klasik, pou egzanp, jiska 1 µg nan ADN mamifè jenomik ak osi piti ke 1 pg nan ADN plasmid. Kantite lajan an pi bon depann lajman sou kantite kopi sekans sib la, osi byen ke sou konpleksite li yo.
Si yo itilize anpil ti modèl, yo pral bezwen yon ogmantasyon korespondan nan kantite sik anplifikasyon pou jwenn yon kantite ase pwodwi. Yon polymerase Taq ki itilize pou pifò eksperyans PCR pa prezante yon fonksyon koreksyon (3′-5′ aktivite eksonukleaz); kidonk, erè ki fèt pandan anplifikasyon pa ka korije. Plis kantite sik yo pi wo, plis anplifikasyon pwodwi ki defekte yo pral pi wo. Si, nan lòt men an, kantite modèl la twò wo, pwobabilite pou primè annealing nan lòt (pa san pousan flater) sekans, osi byen ke fòmasyon nan dimers Jadendanfan, ap ogmante, ki pral lakòz anplifikasyon nan. sous-pwodwi. Nan anpil ka, ADN izole nan kilti selil oswa nan mikwo-òganis epi imedyatman itilize kòm yon modèl PCR. Apre pirifikasyon, li nesesè pou detèmine konsantrasyon ADN pou kapab defini volim ki nesesè pou konfigirasyon PCR la. Pandan ke elèktroforèz jèl agarose ka sèvi pou bay yon estimasyon, metòd sa a pa egzat. Spectrophotometry UV-Vis te etabli kòm estanda lò pou quantification asid nikleyik; metòd sa a dirèk ak Se poutèt sa fasil ak rapid mezire absòbe echantiyon an nan 260 nm, ak konsantrasyon kalkile avèk èd nan yon faktè konvèsyon.
Sepandan, si konsantrasyon ADN a ba anpil (< 1 µg/mL dsDNA), oswa si li kontamine ak sibstans ki absòbe tou nan seri 260 nm (egzanp RNA, pwoteyin, sèl), metòd sa a pral rive nan limit li yo. Nan ka konsantrasyon ki ba anpil, lekti yo pral byento vin twò kòrèk pou yo ka itilize, ak kontaminasyon ap mennen nan (pafwa menmen) surestimasyon nan valè aktyèl la. Nan ka sa a, quantifikasyon lè l sèvi avèk fluoresans ka prezante yon altènatif. Teknik sa a baze sou itilizasyon yon lank fliyoresan ki mare espesyalman nan dsDNA sèlman konplèks ki gen asid nikleyik ak lank ki eksite pa limyè a, epi li pral imedyatman emèt limyè nan yon longèdonn yon ti kras pi wo. Isit la, entansite siyal fliyoresan an pwopòsyonèl ak kantite ADN, epi pou detèmine konsantrasyon an li evalye an relasyon ak yon koub estanda. Avantaj ki genyen nan metòd sa a repoze sou espesifik nan kosyon an, ki eskli enfliyans ekstèn prezante pa kontaminasyon, osi byen ke sou kapasite nan ki kapab lakòz yo detekte konsantrasyon ki ba anpil nan ADN. Konvnab nan nenpòt metòd depann sitou sou konsantrasyon echantiyon ak pite; nan anpil ka li ka menm rekòmande pou aplike tou de metòd an paralèl.
Tan pòs: 30-Nov-2022