Za uspješne reakcije amplifikacije potrebno je da pojedinačne reakcijske komponente budu prisutne u ispravnoj koncentraciji u svakom pripravku. Osim toga, važno je da ne dođe do kontaminacije.
Osobito kada je potrebno postaviti mnogo reakcija, uvriježeno je pripremanje takozvane glavne mješavine umjesto pipetiranja svakog reagensa zasebno u svaku posudu. Komercijalno su dostupne unaprijed konfigurirane mješavine u koje se dodaju samo komponente specifične za uzorak (primer) i voda. Alternativno, glavnu mješavinu možete pripremiti sami. U obje varijante smjesa se raspoređuje u svaku PCR posudu bez predloška i na kraju se zasebno dodaje pojedinačni uzorak DNK.
Korištenje glavne mješavine ima nekoliko prednosti: Prvo, smanjen je broj pojedinačnih koraka pipetiranja. Na taj su način i rizik od pogrešaka korisnika tijekom pipetiranja i rizik od kontaminacije smanjeni na najmanju moguću mjeru i, naravno, ušteđeno je vrijeme. U principu, točnost pipetiranja je također veća, jer se doziraju veće količine. Ovo je lako razumjeti kada se provjeravaju tehnički podaci pipeta: Što je dozirani volumen manji, to odstupanja mogu biti veća. Činjenica da svi pripravci dolaze iz iste posude pozitivno utječe na homogenost (ako su dobro izmiješani). Ovo također poboljšava ponovljivost eksperimenata.
Prilikom pripreme glavne mješavine treba dodati najmanje 10 % dodatnog volumena (npr. ako je potrebno 10 priprema, izračunajte na bazi 11), tako da se i zadnja posuda pravilno napuni. Na taj način se mogu kompenzirati (manje) netočnosti pipetiranja i učinak gubitka uzorka pri doziranju otopina koje sadrže deterdžent. Deterdženti se nalaze u otopinama enzima kao što su polimeraze i glavne mješavine, uzrokujući stvaranje pjene i ostataka na unutarnjoj površini normalnihvrhovi za pipete.
Ovisno o primjeni i vrsti tekućine koju treba dozirati, treba odabrati ispravnu tehniku pipetiranja (1) i odgovarajuću opremu. Za otopine koje sadrže deterdžente preporuča se sustav izravnog istiskivanja ili takozvani vrhovi pipeta s "niskim zadržavanjem" kao alternativa za pipete sa zračnim jastukom. Učinak odACE vrh za pipetutemelji se na posebno hidrofobnoj površini. Tekućine koje sadrže deterdžente ne ostavljaju film zaostatka s unutarnje i vanjske strane, tako da se gubitak otopine može svesti na minimum.
Osim točnog doziranja svih komponenti, također je važno da ne dođe do kontaminacije pripravaka. Nije dovoljno koristiti potrošni materijal visoke čistoće jer postupak pipetiranja u pipeti sa zračnim jastukom može proizvesti aerosole koji ostaju u pipeti. DNK koja se može nalaziti u aerosolu može se prenijeti s jednog uzorka na sljedeći u sljedećem koraku pipetiranja i tako dovesti do kontaminacije. Gore navedeni sustavi izravnog pomaka također mogu smanjiti ovaj rizik. Za pipete sa zračnim jastukom ima smisla koristiti vrhove filtera za zaštitu konusa pipete zadržavanjem prskanja, aerosola i biomolekula.
Vrijeme objave: 6. prosinca 2022