Kriovialeobično se koriste za kriogeno skladištenje staničnih linija i drugih kritičnih bioloških materijala, u dewarovim spremištima ispunjenim tekućim dušikom.

Postoji nekoliko faza uključenih u uspješno očuvanje stanica u tekućem dušiku. Dok je osnovno načelo polagano zamrzavanje, točna tehnika koja se koristi ovisi o vrsti stanice i upotrijebljenom krioprotektoru. Postoji nekoliko sigurnosnih razloga i najboljih praksi koje treba uzeti u obzir prilikom skladištenja ćelija na tako niskim temperaturama.

Ovaj post ima za cilj dati pregled načina na koji se krioviale pohranjuju u tekućem dušiku.

Što su krioviale

Krioviale su male, zatvorene bočice dizajnirane za čuvanje tekućih uzoraka na ekstremno niskim temperaturama. Oni osiguravaju da stanice sačuvane u krioprotektantu ne dođu u izravan kontakt s tekućim dušikom, smanjujući rizik od staničnih lomova dok još uvijek imaju koristi od ekstremnog učinka hlađenja tekućeg dušika.

Bočice su obično dostupne u nizu volumena i dizajna – mogu imati unutarnji ili vanjski navoj s ravnim ili zaobljenim dnom. Dostupni su i sterilni i nesterilni formati.

Tko koristiCyrovialsza pohranjivanje stanica u tekućem dušiku

Niz NHS i privatnih laboratorija, kao i istraživačkih institucija specijaliziranih za bankarstvo krvi iz pupkovine, biologiju epitelnih stanica, imunologiju i biologiju matičnih stanica koriste krioviale za krioprezerviranje stanica.

Stanice sačuvane na ovaj način uključuju B i T stanice, CHO stanice, hematopoetske matične i progenitorske stanice, hibridome, crijevne stanice, makrofage, mezenhimalne matične i progenitorske stanice, monocite, mijelom, NK stanice i pluripotentne matične stanice.

Pregled načina čuvanja krioviala u tekućem dušiku

Krioprezervacija je proces koji čuva stanice i druge biološke konstrukte njihovim hlađenjem na vrlo niske temperature. Stanice se mogu godinama čuvati u tekućem dušiku bez gubitka vitalnosti stanica. Ovo je pregled primijenjenih postupaka.

Priprema stanica

Točna metoda za pripremu uzoraka varirat će ovisno o tipu stanica, ali općenito se stanice prikupljaju i centrifugiraju kako bi se razvila peleta bogata stanicama. Taj se talog zatim resuspendira u supernatantu pomiješanom s krioprotektorom ili medijem za krioprezerviranje.

Medij za krioprezervaciju

Ovaj medij se koristi za očuvanje stanica u okruženjima niske temperature kojima će biti izložene inhibiranjem stvaranja unutarstaničnih i izvanstaničnih kristala, a time i stanične smrti. Njihova je uloga osigurati sigurno, zaštitno okruženje za stanice i tkiva tijekom procesa zamrzavanja, skladištenja i odmrzavanja.

Medij kao što je svježe smrznuta plazma (FFP), otopina hepariniziranog plazmalita ili otopina bez seruma, bez životinjskih komponenti miješa se s krioprotektorima kao što je dimetil sulfoksid (DMSO) ili glicerol.

Ponovno ukapljeni talog uzorka se alikvotira u polipropilenske krioviale kao što jeBiomedicinska tvrtka Suzhou Ace Cryogenic Storage Vials.

Važno je ne prepuniti kriovijule jer se time povećava rizik od pucanja i mogućeg ispuštanja sadržaja (1).

Kontrolirana stopa zamrzavanja

Općenito, spora kontrolirana brzina smrzavanja koristi se za uspješno krioprezerviranje stanica.

Nakon što su uzorci podijeljeni u alikvote u kriogene bočice, stavljaju se na mokri led ili u hladnjak na 4 ℃ i postupak zamrzavanja započinje unutar 5 minuta. Kao opći vodič, stanice se hlade brzinom od -1 do -3 u minuti (2). To se postiže uporabom programabilnog hladnjaka ili stavljanjem bočica u izoliranu kutiju smještenu u zamrzivač s kontroliranom brzinom od –70°C do –90°C.

Prijenos u tekući dušik

Zamrznute kriogene bočice se zatim prenose u spremnik tekućeg dušika na neodređeno vrijeme pod uvjetom da se održava temperatura niža od -135 ℃.

Ove ultra niske temperature mogu se postići uranjanjem u dušik u tekućoj ili parovitoj fazi.

Tekuća ili parna faza?

Poznato je da skladištenje u dušiku u tekućoj fazi održava hladnu temperaturu uz apsolutnu konzistenciju, ali se često ne preporučuje iz sljedećih razloga:

• Potreba za velikim volumenom (dubinom) tekućeg dušika što je potencijalna opasnost. Opekline ili gušenje zbog toga predstavljaju stvarni rizik.
• Dokumentirani slučajevi unakrsne kontaminacije infektivnim uzročnicima kao što su aspergillus, hepatitis B i virus koji se širi putem medija s tekućim dušikom (2,3)
• Mogućnost istjecanja tekućeg dušika u bočice tijekom uranjanja. Kada se izvadi iz skladišta i zagrije na sobnu temperaturu, dušik se brzo širi. Posljedično, bočica se može razbiti kada se izvadi iz skladišta tekućeg dušika, stvarajući opasnost od letećih krhotina i izlaganja sadržaju (1, 4).

Iz tih razloga, skladištenje na ultra niskim temperaturama najčešće je u dušiku u fazi pare. Kada se uzorci moraju pohraniti u tekućoj fazi, treba koristiti specijalizirane cryoflex cijevi.

Loša strana parne faze je da može doći do vertikalnog temperaturnog gradijenta što rezultira temperaturnim fluktuacijama između -135 ℃ i -190 ℃. To zahtijeva pažljivo i marljivo praćenje razina tekućeg dušika i temperaturnih varijacija (5).

Mnogi proizvođači preporučuju da su krioviale prikladne za skladištenje do -135 ℃ ili samo za upotrebu u fazi pare.

Odmrzavanje vaših kriokonzerviranih stanica

Postupak odmrzavanja je stresan za smrznutu kulturu, a potrebno je pravilno rukovanje i tehnika kako bi se osigurala optimalna održivost, oporavak i funkcionalnost stanica. Točni protokoli odmrzavanja ovisit će o specifičnim tipovima stanica. Međutim, brzo se odmrzavanje smatra standardnim za:

• Smanjite svaki utjecaj na oporavak stanica
• Pomognite smanjiti vrijeme izlaganja otopljenim tvarima prisutnim u mediju za zamrzavanje
• Smanjite bilo kakvu štetu rekristalizacijom leda

Za odmrzavanje uzoraka obično se koriste vodene kupke, kupke s kuglicama ili specijalizirani automatizirani instrumenti.

Najčešće se 1 stanična linija odmrzava odjednom 1-2 minute, laganim miješanjem u vodenoj kupelji na 37 ℃ sve dok u bočici ne ostane samo malo leda prije nego što se isperu u prethodno zagrijanom mediju za rast.

Za neke stanice, poput embrija sisavaca, polagano zagrijavanje bitno je za njihov opstanak.

Stanice su sada spremne za kulturu stanica, izolaciju stanica ili u slučaju hematopoetskih matičnih stanica – studije održivosti kako bi se zajamčio integritet matičnih stanica donora prije mijeloablativne terapije.

Uobičajena je praksa uzeti male alikvote prethodno ispranog uzorka koji se koristi za prebrojavanje stanica kako bi se odredile koncentracije stanica za ploču u kulturi. Zatim možete procijeniti rezultate postupaka izolacije stanica i odrediti njihovu održivost.

Najbolje prakse za skladištenje krioviala

Uspješno krioprezerviranje uzoraka pohranjenih u kriovijalama ovisi o mnogim elementima u protokolu, uključujući pravilno skladištenje i vođenje evidencije.

• Podijelite ćelije između lokacija za pohranu– Ako volumeni dopuštaju, razdijelite ćelije između bočica i pohranite ih na odvojenim mjestima kako biste smanjili rizik od gubitka uzorka zbog kvarova na opremi.
• Spriječiti unakrsnu kontaminaciju– Odlučite se za sterilne kriogene bočice za jednokratnu upotrebu ili autoklav prije sljedeće uporabe
• Koristite bočice odgovarajuće veličine za svoje stanice– bočice dolaze u rasponu volumena između 1 i 5 ml. Izbjegavajte prepunjavanje bočica kako biste smanjili rizik od pucanja.
• Odaberite kriogene bočice s unutarnjim ili vanjskim navojem– Neka sveučilišta preporučuju bočice s unutarnjim navojem kao sigurnosne mjere – one također mogu spriječiti kontaminaciju tijekom punjenja ili skladištenja u tekućem dušiku.
• Spriječite curenje- Koristite dvostruke ubrizgane brtve ulivene u navojni čep ili O-prstenove kako biste spriječili curenje i kontaminaciju.
• Koristite 2D barkodove i označite bočice– kako bi se osigurala sljedivost, bočice s velikim površinama za pisanje omogućuju da svaka bočica bude odgovarajuće označena. 2D crtični kodovi mogu pomoći u upravljanju pohranom i vođenju evidencije. Kapice označene bojama korisne su za lakšu identifikaciju.
• Adekvatno održavanje skladišta- Kako bi se osiguralo da se stanice ne izgube, posude za skladištenje trebale bi stalno pratiti temperaturu i razine tekućeg dušika. Alarmi bi trebali biti postavljeni kako bi upozorili korisnike na pogreške.

Sigurnosne mjere opreza

Tekući dušik postao je uobičajena praksa u modernim istraživanjima, ali nosi rizik od ozbiljnih ozljeda ako se nepravilno koristi.

Treba nositi odgovarajuću osobnu zaštitnu opremu (PPE) kako bi se smanjio rizik od ozeblina, opeklina i drugih štetnih incidenata pri rukovanju tekućim dušikom. Nositi

• Kriogene rukavice
• Laboratorijski kaput
• Štitnik za cijelo lice otporan na udarce koji pokriva i vrat
• Cipele sa zatvorenim prstima
• Plastična pregača otporna na prskanje

Hladnjaci s tekućim dušikom trebali bi se postaviti u dobro prozračene prostore kako bi se smanjio rizik od gušenja – ispušteni dušik isparava i istiskuje atmosferski kisik. Prodavaonice velikih količina trebale bi imati alarmne sustave za nisku razinu kisika.

Rad u paru pri rukovanju tekućim dušikom je idealan i njegovu upotrebu izvan uobičajenog radnog vremena treba zabraniti.

Krioviale za podršku vašem tijeku rada

Tvrtka Suzhou Ace Biomedical nudi širok izbor proizvoda koji zadovoljavaju vaše potrebe za krioprezervacijom za različite vrste stanica. Portfelj uključuje niz epruveta kao i niz sterilnih krioviala.

Naše kriovijele su:

• Laboratorijska navojna kapica 0,5 mL 1,5 mL 2,0 mL Kriovijalne kriogene bočice Kriotube s koničnim dnom i brtvom

  ● 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml specifikacija, s rubom ili bez ruba
  ● Dostupni su stožasti ili samostojeći dizajn, sterilni ili nesterilni
  ● Tube s poklopcem s navojem izrađene su od medicinskog polipropilena
  ● PP Cryotube bočice mogu se više puta zamrzavati i odmrzavati
  ● Vanjski dizajn poklopca može smanjiti vjerojatnost kontaminacije tijekom obrade uzorka.
  ● Kriogene cijevi s poklopcem s navojem Univerzalni navoj za uporabu
  ● Cijevi odgovaraju većini uobičajenih rotora
  ● O-ring cijevi za kriogene cijevi odgovaraju standardnim kutijama za zamrzavanje od 1 inča i 2 inča, 48 jažica, 81 jažica， 96 jažica i 100 jažica
  ● Može se autoklavirati do 121°C i zamrzavati do -86°C

  DIO BR	MATERIJAL	VOLUMEN	CAPBOJA	PCS/TORBA	TORBE/TORBICA
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Crna, žuta, plava, crvena, ljubičasta, bijela	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Crna, žuta, plava, crvena, ljubičasta, bijela	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Crna, žuta, plava, crvena, ljubičasta, bijela	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Crna, žuta, plava, crvena, ljubičasta, bijela	500	10