Uvod
Što je ekstrakcija nukleinske kiseline?
Najjednostavnije rečeno, ekstrakcija nukleinske kiseline je uklanjanje RNA i/ili DNA iz uzorka i svog viška koji nije potreban. Proces ekstrakcije izolira nukleinske kiseline iz uzorka i daje ih u obliku koncentriranog eluata, bez razrjeđivača i kontaminanata koji bi mogli utjecati na daljnje primjene.
Primjene ekstrakcije nukleinskih kiselina
Pročišćene nukleinske kiseline koriste se u mnoštvu različitih primjena, u rasponu od više različitih industrija. Zdravstvo je možda područje u kojem se najviše koristi, s pročišćenom RNK i DNK potrebnom za niz različitih ili različitih svrha testiranja.
Primjene ekstrakcije nukleinske kiseline u zdravstvu uključuju:
- Sekvenciranje sljedeće generacije (NGS)
- SNP genotipizacija temeljena na pojačanju
- Genotipizacija temeljena na nizu
- Probava restrikcijskim enzimima
- Analize pomoću modificirajućih enzima (npr. ligacija i kloniranje)
Postoje i druga područja izvan zdravstvene skrbi u kojima se koristi ekstrakcija nukleinske kiseline, uključujući ali ne ograničavajući se na testiranje očinstva, forenziku i genomiku.
Kratka povijest ekstrakcije nukleinske kiseline
ekstrakcija DNKseže daleko u prošlost, a prvu poznatu izolaciju izveo je švicarski liječnik po imenu Friedrich Miescher 1869. godine. Miescher se nadao da će riješiti temeljna načela života određivanjem kemijskog sastava stanica. Nakon što nije uspio s limfocitima, uspio je dobiti grubi talog DNK iz leukocita pronađenih u gnoju na odbačenim zavojima. Učinio je to dodavanjem kiseline, a zatim lužine u stanicu kako bi izašao iz stanične citoplazme, a zatim je razvio protokol za odvajanje DNK od ostalih proteina.
Nakon Miescherovog revolucionarnog istraživanja, mnogi drugi znanstvenici su napredovali i razvili tehnike za izolaciju i pročišćavanje DNK. Edwin Joseph Cohn, proteinski znanstvenik razvio je mnoge tehnike za pročišćavanje proteina tijekom Drugog svjetskog rata. Bio je odgovoran za izolaciju serumske albuminske frakcije krvne plazme, koja je važna za održavanje osmotskog tlaka u krvnim žilama. To je bilo ključno za održavanje vojnika na životu.
Godine 1953. Francis Crick, zajedno s Rosalind Franklin i Jamesom Watsonom, odredio je strukturu DNK, pokazujući da se ona sastoji od dva lanca dugih lanaca nukleotida nukleinske kiseline. Ovo revolucionarno otkriće utrlo je put Meselsonu i Stahlu, koji su uspjeli razviti protokol centrifugiranja s gradijentom gustoće za izolaciju DNK iz bakterije E. Coli dok su demonstrirali polukonzervativnu replikaciju DNK tijekom svog eksperimenta 1958. godine.
Tehnike ekstrakcije nukleinskih kiselina
Koje su 4 faze ekstrakcije DNK?
Sve metode ekstrakcije svode se na iste temeljne korake.
Poremećaj stanica. Ova faza, također poznata kao stanična liza, uključuje razbijanje stanične stijenke i/ili stanične membrane, kako bi se oslobodile unutarstanične tekućine koje sadrže nukleinske kiseline od interesa.
Uklanjanje neželjenih ostataka. To uključuje membranske lipide, proteine i druge neželjene nukleinske kiseline koje mogu ometati daljnje primjene.
Izolacija. Postoji nekoliko različitih načina za izolaciju nukleinskih kiselina od interesa iz pročišćenog lizata koji ste stvorili, a koji spadaju u dvije glavne kategorije: na bazi otopine ili u čvrstom stanju (vidi sljedeći odjeljak).
Koncentracija. Nakon što su nukleinske kiseline izolirane od svih ostalih kontaminanata i razrjeđivača, one se prezentiraju u visoko koncentriranom eluatu.
Dvije vrste ekstrakcije
Postoje dvije vrste ekstrakcije nukleinske kiseline – metode temeljene na otopini i metode čvrstog stanja. Metoda temeljena na otopini također je poznata kao metoda kemijske ekstrakcije, budući da uključuje korištenje kemikalija za razgradnju stanice i pristup nukleinskom materijalu. To može biti korištenje organskih spojeva poput fenola i kloroforma ili manje štetnih i stoga preporučljivijih anorganskih spojeva poput proteinaze K ili silika gela.
Primjeri različitih metoda kemijske ekstrakcije za razgradnju stanica uključuju:
- Osmotsko pucanje membrane
- Enzimska probava stanične stijenke
- Solubilizacija membrane
- S deterdžentima
- S alkalnom obradom
Tehnike čvrstog stanja, poznate i kao mehaničke metode, uključuju iskorištavanje načina na koji DNA stupa u interakciju s čvrstim supstratom. Odabirom kuglice ili molekule na koju će se DNK vezati, ali analit neće, moguće je to dvoje razdvojiti. Primjeri tehnika ekstrakcije čvrste faze uključujući upotrebu silicijevog dioksida i magnetskih kuglica.
Objašnjenje ekstrakcije magnetskih kuglica
Metoda ekstrakcije magnetskih kuglica
Potencijal za ekstrakciju korištenjem magnetskih kuglica prvi je put prepoznat u američkom patentu koji je prijavio Trevor Hawkins, za istraživačku instituciju Whitehead Institute. Ovaj patent je potvrdio da je moguće ekstrahirati genetski materijal njihovim vezanjem na čvrsti nosač, što bi mogla biti magnetska kuglica. Načelo je da koristite visokofunkcionalna magnetska zrnca na koja će se vezati genetski materijal, koji se zatim može odvojiti od supernatanta primjenom magnetske sile na vanjsku stranu posude koja drži uzorak.
Zašto koristiti ekstrakciju magnetskih kuglica?
Tehnologija ekstrakcije magnetskih kuglica postaje sve raširenija zbog potencijala koji ima za brze i učinkovite postupke ekstrakcije. U novije vrijeme došlo je do razvoja visoko funkcionaliziranih magnetskih kuglica s odgovarajućim puferskim sustavima, koji su omogućili automatizaciju ekstrakcije nukleinske kiseline i tijek rada koji je vrlo lagan i troškovno učinkovit. Također, metode ekstrakcije magnetskih kuglica ne uključuju korake centrifugiranja koji mogu uzrokovati sile smicanja koje razbijaju duže dijelove DNK. To znači da duži lanci DNK ostaju netaknuti, što je važno u genomskom testiranju.
Vrijeme objave: 25. studenoga 2022