Iako bi u teoriji bila dovoljna jedna molekula predloška, znatno veće količine DNA obično se koriste za klasični PCR, na primjer, do 1 µg genomske DNA sisava i samo 1 pg plazmidne DNA. Optimalna količina u velikoj mjeri ovisi o broju primjeraka ciljanog niza, kao i o njegovoj složenosti.
Ako se koristi vrlo malo predloška, za dobivanje dovoljne količine proizvoda bit će potrebno odgovarajuće povećanje broja ciklusa pojačanja. Taq polimeraza koja se koristi za većinu PCR eksperimenata ne sadrži funkciju korekcije (aktivnost 3'-5 'egzonukleaze); Stoga se pogreške koje se javljaju tijekom pojačanja ne mogu ispraviti. Što je veći broj ciklusa, to će biti rasprostranjeniji pojačavanje pogrešnog proizvoda. Ako je, s druge strane, količina predloška previsoka, vjerojatnost da će se primera za žale na druge (ne sto posto besplatne) sekvence, kao i stvaranje dimera primera, povećati, što će rezultirati pojačavanjem nusproizvodi. U mnogim slučajevima DNK je izolirana iz staničnih kultura ili od mikroorganizama, a potom se koristi kao PCR predložak. Nakon pročišćavanja, potrebno je odrediti koncentraciju DNK kako bi se mogla definirati volumen koji je potreban za postavljanje PCR -a. Iako elektroforeza agaroze gela može poslužiti za procjenu, ova je metoda daleko od točne. UV-Vis spektrofotometrija utvrđena je kao zlatni standard za kvantifikaciju nukleinskih kiselina; Ova izravna i stoga jednostavna i brza metoda mjeri apsorbanciju uzorka na 260 nm, a koncentracija se izračunava uz pomoć faktora pretvorbe.
Ako je koncentracija DNA vrlo niska (<1 µg/ml dsDNA), ili ako je kontaminirana tvarima koje također apsorbiraju u rasponu od 260 nm (npr. RNA, protein, soli), ova će metoda doseći njegova ograničenja. U slučaju vrlo niskih koncentracija, očitanja će uskoro postati previše netočna da bi bila od koristi, a onečišćenja će dovesti do (ponekad ogromne) precijenjenja stvarne vrijednosti. U ovom slučaju kvantifikacija pomoću fluorescencije može predstavljati alternativu. Ova se tehnika temelji na upotrebi fluorescentne boje koja se posebno veže na dsDNA, samo kompleks koji sadrži nukleinsku kiselinu i boju uzbuđuje svjetlost, a naknadno će emitirati svjetlost nešto veće valne duljine. Ovdje je intenzitet fluorescentnog signala proporcionalan količini DNK, a za određivanje koncentracije ona se procjenjuje u odnosu na standardnu krivulju. Prednosti ove metode počivaju na specifičnosti veze, koja isključuje vanjske utjecaje uvedene kontaminacijom, kao i na rezultirajuću sposobnost otkrivanja vrlo niskih koncentracija DNK. Prikladnost bilo koje metode ovisi uglavnom o koncentraciji uzorka i čistoći; U mnogim slučajevima može biti i preporučljivo primijeniti obje metode paralelno.
Vrijeme posta: studenoga 30-2022