Koliko predloška trebamo dodati mojoj PCR reakciji?

Iako bi u teoriji jedna molekula kalupa bila dovoljna, za klasičnu PCR tipično se koriste znatno veće količine DNA, na primjer do 1 µg genomske DNA sisavaca i samo 1 pg plazmidne DNA. Optimalna količina uvelike ovisi o broju kopija ciljne sekvence, kao i o njezinoj složenosti.

Ako se koristi vrlo malo predloška, ​​bit će potrebno odgovarajuće povećanje u broju ciklusa amplifikacije kako bi se dobila dovoljna količina produkta. Taq polimeraza koja se koristi za većinu PCR eksperimenata nema funkciju korekcije (3'-5' egzonukleazna aktivnost); stoga se greške nastale tijekom pojačanja ne mogu ispraviti. Što je veći broj ciklusa, to će pojačanje manjkavog proizvoda biti češće. Ako je, s druge strane, količina templata prevelika, povećat će se vjerojatnost spajanja primera s drugim (ne stopostotno komplementarnim) slijedovima, kao i formiranje dimera primera, što će rezultirati amplificiranjem nusproizvodi. U mnogim slučajevima, DNA se izolira iz staničnih kultura ili iz mikroorganizama i zatim se koristi kao PCR obrazac. Nakon pročišćavanja potrebno je odrediti koncentraciju DNA kako bi se mogao definirati volumen koji je potreban za postavljanje PCR-a. Dok elektroforeza u agaroznom gelu može poslužiti za procjenu, ova metoda je daleko od točne. UV-Vis spektrofotometrija uspostavljena je kao zlatni standard za kvantifikaciju nukleinskih kiselina; ovom izravnom i stoga jednostavnom i brzom metodom mjeri se apsorbancija uzorka na 260 nm, a koncentracija se izračunava uz pomoć faktora konverzije.

Međutim, ako je koncentracija DNA vrlo niska (< 1 µg/mL dsDNA), ili ako je kontaminirana tvarima koje također apsorbiraju u rasponu od 260 nm (npr. RNA, protein, soli), ova metoda će doći do svojih ograničenja. U slučaju vrlo niskih koncentracija, očitanja će uskoro postati previše neprecizna da bi bila od koristi, a onečišćenja će dovesti do (ponekad enormnog) precjenjivanja stvarne vrijednosti. U ovom slučaju, kvantifikacija pomoću fluorescencije može predstavljati alternativu. Ova se tehnika temelji na korištenju fluorescentne boje koja se specifično veže na dsDNA samo se kompleks koji sadrži nukleinsku kiselinu i boju pobuđuje svjetlom, a zatim će emitirati svjetlost nešto veće valne duljine. Ovdje je intenzitet fluorescentnog signala proporcionalan količini DNA, a za određivanje koncentracije procjenjuje se u odnosu na standardnu ​​krivulju. Prednosti ove metode počivaju na specifičnosti veze, koja isključuje vanjske utjecaje unesene kontaminacijom, kao i na rezultirajućoj sposobnosti detekcije vrlo niskih koncentracija DNA. Prikladnost bilo koje metode ovisi uglavnom o koncentraciji uzorka i čistoći; u mnogim slučajevima može čak biti preporučljivo primijeniti obje metode paralelno.


Vrijeme objave: 30. studenoga 2022