न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण और चुंबकीय मनका विधि

परिचय

न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण क्या है?

बहुत ही सरल शब्दों में, न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण एक नमूने से आरएनए और/या डीएनए को हटाने और सभी अतिरिक्त है जो आवश्यक नहीं है। निष्कर्षण की प्रक्रिया न्यूक्लिक एसिड को एक नमूने से अलग करती है और उन्हें एक केंद्रित एलिट के रूप में पैदावार करती है, जो कि मंदक और दूषित पदार्थों से मुक्त होती है जो किसी भी डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों को प्रभावित कर सकते हैं।

न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के अनुप्रयोग

शुद्ध न्यूक्लिक एसिड का उपयोग विभिन्न अनुप्रयोगों के ढेरों में किया जाता है, कई अलग -अलग उद्योगों में। हेल्थकेयर शायद वह क्षेत्र है जहां इसका सबसे अधिक उपयोग किया जाता है, शुद्ध आरएनए और डीएनए के साथ विभिन्न परीक्षण उद्देश्यों के विभिन्न मेजबान के लिए आवश्यक है।

स्वास्थ्य सेवा में न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के अनुप्रयोगों में शामिल हैं:

- पीसीआर और क्यूपीसीआर प्रवर्धन

- नेक्स्ट जनरेशन सीक्वेंसिंग (एनजीएस)

- प्रवर्धन-आधारित एसएनपी जीनोटाइपिंग

- सरणी-आधारित जीनोटाइपिंग

- प्रतिबंध एंजाइम पाचन

- संशोधित एंजाइमों का उपयोग करके विश्लेषण (जैसे बंधाव और क्लोनिंग)

हेल्थकेयर से परे अन्य क्षेत्र भी हैं जहां न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण का उपयोग किया जाता है, लेकिन पितृत्व परीक्षण, फोरेंसिक और जीनोमिक्स तक सीमित नहीं है।

न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण का एक संक्षिप्त इतिहास

डीएनए निष्कर्षणएक लंबा रास्ता तय करता है, जिसमें 1869 में फ्रेडरिक मिज्चर नामक एक स्विस चिकित्सक द्वारा पहला ज्ञात अलगाव किया गया था। Miescher कोशिकाओं की रासायनिक संरचना का निर्धारण करके जीवन के मूल सिद्धांतों को हल करने की उम्मीद कर रहा था। लिम्फोसाइट्स के साथ विफल होने के बाद, वह त्यागित पट्टियों पर मवाद में पाए जाने वाले ल्यूकोसाइट्स से डीएनए का एक कच्चा अवक्षेप प्राप्त करने में सक्षम था। उन्होंने सेल के साइटोप्लाज्म को छोड़ने के लिए सेल में एसिड और फिर क्षार जोड़कर ऐसा किया, और फिर डीएनए को अन्य प्रोटीन से अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया।

Miescher के ग्राउंड-ब्रेकिंग शोध के बाद, कई अन्य वैज्ञानिकों ने डीएनए को अलग करने और शुद्ध करने के लिए तकनीकों को आगे बढ़ाने और विकसित करने के लिए आगे बढ़े हैं। एडविन जोसेफ कोहन, एक प्रोटीन वैज्ञानिक ने WW2 के दौरान प्रोटीन शुद्धि के लिए कई तकनीकों को विकसित किया। वह रक्त प्लाज्मा के सीरम एल्ब्यूमिन अंश को अलग करने के लिए जिम्मेदार था, जो रक्त वाहिकाओं में आसमाटिक दबाव को बनाए रखने में महत्वपूर्ण है। सैनिकों को जीवित रखने के लिए यह महत्वपूर्ण था।

1953 में, फ्रांसिस क्रिक, रोजालिंड फ्रैंकलिन और जेम्स वॉटसन के साथ, डीएनए की संरचना का निर्धारण करते हुए, यह दिखाते हुए कि यह न्यूक्लिक एसिड न्यूक्लियोटाइड की लंबी श्रृंखलाओं के दो किस्में से बना था। इस सफलता की खोज ने मेसेल्सन और स्टाल के लिए मार्ग प्रशस्त किया, जो ई। कोलाई बैक्टीरिया से डीएनए को अलग करने के लिए एक घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन प्रोटोकॉल विकसित करने में सक्षम थे क्योंकि उन्होंने अपने 1958 के प्रयोग के दौरान डीएनए के अर्ध-रूढ़िवादी प्रतिकृति का प्रदर्शन किया था।

न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण की तकनीक

डीएनए निष्कर्षण के 4 चरण क्या हैं?
सभी निष्कर्षण विधियां एक ही मौलिक चरणों में उबालते हैं।

कोशिका विघटन। यह चरण, जिसे सेल lysis के रूप में भी जाना जाता है, में सेल की दीवार और/या सेल झिल्ली को तोड़ना शामिल है, ताकि इंट्रा-सेलुलर तरल पदार्थों को ब्याज के न्यूक्लिक एसिड युक्त रिलीज़ किया जा सके।

अवांछित मलबे को हटाना। इसमें झिल्ली लिपिड, प्रोटीन और अन्य अवांछित न्यूक्लिक एसिड शामिल हैं जो डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं।

एकांत। आपके द्वारा बनाए गए क्लीयर लिसेट से ब्याज के न्यूक्लिक एसिड को अलग करने के लिए कई अलग -अलग तरीके हैं, जो दो मुख्य श्रेणियों के बीच आते हैं: समाधान आधारित या ठोस स्थिति (अगला खंड देखें)।

एकाग्रता। न्यूक्लिक एसिड को अन्य सभी संदूषकों और मंदक से अलग होने के बाद, उन्हें एक उच्च-केंद्रित eluate में प्रस्तुत किया जाता है।

दो प्रकार के निष्कर्षण
न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के दो प्रकार हैं - समाधान आधारित तरीके और ठोस राज्य विधियाँ। समाधान आधारित विधि को रासायनिक निष्कर्षण विधि के रूप में भी जाना जाता है, क्योंकि इसमें सेल को तोड़ने और न्यूक्लिक सामग्री तक पहुंचने के लिए रसायनों का उपयोग करना शामिल है। यह या तो कार्बनिक यौगिकों जैसे कि फिनोल और क्लोरोफॉर्म, या कम हानिकारक और इसलिए अधिक अनुशंसित अकार्बनिक यौगिकों जैसे कि प्रोटीनस के या सिलिका जेल का उपयोग कर सकता है।

एक सेल को तोड़ने के लिए विभिन्न रासायनिक निष्कर्षण विधियों के उदाहरणों में शामिल हैं:

- झिल्ली का आसमाटिक टूटना

- सेल की दीवार का एंजाइमेटिक पाचन

- झिल्ली का विलेयता

- डिटर्जेंट के साथ

- क्षार उपचार के साथ

ठोस राज्य तकनीकों, जिसे यांत्रिक तरीकों के रूप में भी जाना जाता है, में यह शोषण करना शामिल है कि डीएनए एक ठोस सब्सट्रेट के साथ कैसे बातचीत करता है। एक मनका या अणु का चयन करके जो डीएनए को बांध देगा, लेकिन विश्लेषण नहीं करेगा, दोनों को अलग करना संभव है। सिलिका और चुंबकीय मोतियों का उपयोग करने सहित ठोस-चरण निष्कर्षण तकनीकों के उदाहरण।

चुंबकीय मनका निष्कर्षण समझाया

चुंबकीय मनका निष्कर्षण विधि
व्हाइटहेड इंस्टीट्यूट रिसर्च इंस्टीट्यूशन के लिए ट्रेवर हॉकिन्स द्वारा दायर अमेरिकी पेटेंट में चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके निष्कर्षण की क्षमता को पहले मान्यता दी गई थी। इस पेटेंट ने स्वीकार किया कि आनुवंशिक सामग्री को एक ठोस समर्थन वाहक से बांधकर आनुवंशिक सामग्री निकालना संभव था, जो एक चुंबकीय मनका हो सकता है। सिद्धांत यह है कि आप एक अत्यधिक कार्यात्मक चुंबकीय मनका का उपयोग करते हैं, जिस पर आनुवंशिक सामग्री को बांधना होगा, जिसे बाद में नमूना पकड़े हुए पोत के बाहर एक चुंबकीय बल को लागू करके सतह पर तैरनेवाला से अलग किया जा सकता है।

चुंबकीय मनका निष्कर्षण का उपयोग क्यों करें?
चुंबकीय मनका निष्कर्षण तकनीक तेजी से प्रचलित हो रही है, क्षमता के कारण यह तेजी से और कुशल निष्कर्षण प्रक्रियाओं के लिए रखती है। हाल के दिनों में उपयुक्त बफर सिस्टम के साथ अत्यधिक कार्यात्मक चुंबकीय मोतियों के विकास हुए हैं, जिन्होंने न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण और एक वर्कफ़्लो का संभव स्वचालन बनाया है जो बहुत संसाधन प्रकाश और लागत-कुशल है। इसके अलावा, चुंबकीय मनका निष्कर्षण विधियों में सेंट्रीफ्यूजेशन चरण शामिल नहीं होते हैं जो कतरनी बलों का कारण बन सकते हैं जो डीएनए के लंबे टुकड़ों को तोड़ते हैं। इसका मतलब यह है कि डीएनए के लंबे समय तक किस्में बरकरार रहती हैं, जो जीनोमिक्स परीक्षण में महत्वपूर्ण है।