न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण और चुंबकीय मनका विधि

परिचय

न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण क्या है?

सबसे सरल शब्दों में, न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण एक नमूने से आरएनए और/या डीएनए और सभी अनावश्यक को हटाना है। निष्कर्षण की प्रक्रिया एक नमूने से न्यूक्लिक एसिड को अलग करती है और उन्हें एक केंद्रित एलुएट के रूप में उत्पन्न करती है, जो मंदक और संदूषकों से मुक्त होती है जो किसी भी डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों को प्रभावित कर सकती है।

न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के अनुप्रयोग

शुद्ध किए गए न्यूक्लिक एसिड का उपयोग कई अलग-अलग उद्योगों में विभिन्न अनुप्रयोगों में किया जाता है। हेल्थकेयर शायद वह क्षेत्र है जहां इसका सबसे अधिक उपयोग किया जाता है, विभिन्न परीक्षण उद्देश्यों के लिए शुद्ध आरएनए और डीएनए की आवश्यकता होती है।

स्वास्थ्य देखभाल में न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के अनुप्रयोगों में शामिल हैं:

- पीसीआर और क्यूपीसीआर प्रवर्धन

- अगली पीढ़ी अनुक्रमण (एनजीएस)

- प्रवर्धन-आधारित एसएनपी जीनोटाइपिंग

- सारणी-आधारित जीनोटाइपिंग

- प्रतिबंध एंजाइम पाचन

- संशोधित एंजाइमों (जैसे लिगेशन और क्लोनिंग) का उपयोग करके विश्लेषण

स्वास्थ्य देखभाल से परे अन्य क्षेत्र भी हैं जहां न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण का उपयोग किया जाता है, जिसमें पितृत्व परीक्षण, फोरेंसिक और जीनोमिक्स शामिल हैं, लेकिन इन्हीं तक सीमित नहीं हैं।

न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण का एक संक्षिप्त इतिहास

डीएनए निष्कर्षणइसका इतिहास बहुत पुराना है, पहला ज्ञात पृथक्करण 1869 में फ्रेडरिक मिशर नामक एक स्विस चिकित्सक द्वारा किया गया था। मिशर कोशिकाओं की रासायनिक संरचना का निर्धारण करके जीवन के मूलभूत सिद्धांतों को हल करने की उम्मीद कर रहा था। लिम्फोसाइटों के साथ असफल होने के बाद, वह छोड़ी गई पट्टियों पर मवाद में पाए जाने वाले ल्यूकोसाइट्स से डीएनए का एक अपरिष्कृत अवक्षेप प्राप्त करने में सक्षम था। उन्होंने कोशिका के साइटोप्लाज्म को छोड़ने के लिए कोशिका में एसिड और फिर क्षार जोड़कर ऐसा किया, और फिर डीएनए को अन्य प्रोटीन से अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया।

मिशर के अभूतपूर्व शोध के बाद, कई अन्य वैज्ञानिक डीएनए को अलग करने और शुद्ध करने के लिए तकनीकों को आगे बढ़ाने और विकसित करने में लगे हुए हैं। प्रोटीन वैज्ञानिक एडविन जोसेफ कोहन ने द्वितीय विश्व युद्ध के दौरान प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए कई तकनीकें विकसित कीं। वह रक्त प्लाज्मा के सीरम एल्ब्यूमिन अंश को अलग करने के लिए जिम्मेदार था, जो रक्त वाहिकाओं में आसमाटिक दबाव को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। सैनिकों को जीवित रखने के लिए यह महत्वपूर्ण था।

1953 में फ्रांसिस क्रिक ने रोजालिंड फ्रैंकलिन और जेम्स वॉटसन के साथ मिलकर डीएनए की संरचना निर्धारित की, जिससे पता चला कि यह न्यूक्लिक एसिड न्यूक्लियोटाइड की लंबी श्रृंखलाओं की दो श्रृंखलाओं से बना है। इस सफल खोज ने मेसेलसन और स्टाल के लिए मार्ग प्रशस्त किया, जो ई. कोली बैक्टीरिया से डीएनए को अलग करने के लिए एक घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन प्रोटोकॉल विकसित करने में सक्षम थे क्योंकि उन्होंने अपने 1958 के प्रयोग के दौरान डीएनए की अर्ध-रूढ़िवादी प्रतिकृति का प्रदर्शन किया था।

न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण की तकनीकें

डीएनए निष्कर्षण के 4 चरण क्या हैं?
सभी निष्कर्षण विधियाँ समान मूलभूत चरणों तक सीमित हैं।

कोशिका व्यवधान. इस चरण को, जिसे कोशिका लसीका के रूप में भी जाना जाता है, इसमें कोशिका भित्ति और/या कोशिका झिल्ली को तोड़ना शामिल है, ताकि रुचि के न्यूक्लिक एसिड युक्त इंट्रा-सेलुलर तरल पदार्थ को छोड़ा जा सके।

अवांछित मलबा हटाना. इसमें झिल्ली लिपिड, प्रोटीन और अन्य अवांछित न्यूक्लिक एसिड शामिल हैं जो डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में हस्तक्षेप कर सकते हैं।

एकांत। आपके द्वारा बनाए गए क्लीयर लाइसेट से रुचि के न्यूक्लिक एसिड को अलग करने के कई अलग-अलग तरीके हैं, जो दो मुख्य श्रेणियों के बीच आते हैं: समाधान आधारित या ठोस अवस्था (अगला भाग देखें)।

एकाग्रता। न्यूक्लिक एसिड को अन्य सभी संदूषकों और मंदकों से अलग करने के बाद, उन्हें अत्यधिक केंद्रित निक्षालन में प्रस्तुत किया जाता है।

निष्कर्षण के दो प्रकार
न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण दो प्रकार के होते हैं - समाधान आधारित विधियाँ और ठोस अवस्था विधियाँ। समाधान आधारित विधि को रासायनिक निष्कर्षण विधि के रूप में भी जाना जाता है, क्योंकि इसमें कोशिका को तोड़ने और न्यूक्लिक सामग्री तक पहुंचने के लिए रसायनों का उपयोग करना शामिल है। इसमें या तो फिनोल और क्लोरोफॉर्म जैसे कार्बनिक यौगिकों का उपयोग किया जा सकता है, या कम हानिकारक और इसलिए अधिक अनुशंसित अकार्बनिक यौगिकों जैसे कि प्रोटीनेज के या सिलिका जेल का उपयोग किया जा सकता है।

किसी कोशिका को तोड़ने के लिए विभिन्न रासायनिक निष्कर्षण विधियों के उदाहरणों में शामिल हैं:

- झिल्ली का आसमाटिक टूटना

- कोशिका भित्ति का एंजाइमेटिक पाचन

- झिल्ली का घुलनशीलीकरण

- डिटर्जेंट के साथ

- क्षार उपचार के साथ

ठोस अवस्था तकनीक, जिसे यांत्रिक तरीकों के रूप में भी जाना जाता है, में यह पता लगाना शामिल है कि डीएनए एक ठोस सब्सट्रेट के साथ कैसे संपर्क करता है। एक मनका या अणु का चयन करके जिस पर डीएनए बंधेगा लेकिन विश्लेषक नहीं जुड़ेगा, दोनों को अलग करना संभव है। सिलिका और चुंबकीय मोतियों का उपयोग सहित ठोस-चरण निष्कर्षण तकनीकों के उदाहरण।

चुंबकीय मनका निष्कर्षण समझाया गया

चुंबकीय मनका निष्कर्षण विधि
चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके निष्कर्षण की क्षमता को पहली बार व्हाइटहेड इंस्टीट्यूट अनुसंधान संस्थान के लिए ट्रेवर हॉकिन्स द्वारा दायर एक अमेरिकी पेटेंट में पहचाना गया था। इस पेटेंट ने स्वीकार किया कि आनुवंशिक सामग्री को एक ठोस समर्थन वाहक से बांधकर निकालना संभव है, जो एक चुंबकीय मनका हो सकता है। सिद्धांत यह है कि आप एक अत्यधिक कार्यात्मक चुंबकीय मनका का उपयोग करते हैं जिस पर आनुवंशिक सामग्री बंध जाएगी, जिसे नमूना रखने वाले बर्तन के बाहर चुंबकीय बल लागू करके सतह पर तैरनेवाला से अलग किया जा सकता है।

चुंबकीय मनका निष्कर्षण का उपयोग क्यों करें?
तीव्र और कुशल निष्कर्षण प्रक्रियाओं की क्षमता के कारण चुंबकीय मनका निष्कर्षण तकनीक तेजी से प्रचलित हो रही है। हाल के दिनों में उपयुक्त बफर सिस्टम के साथ अत्यधिक कार्यात्मक चुंबकीय मोतियों का विकास हुआ है, जिसने न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के स्वचालन और एक वर्कफ़्लो को संभव बनाया है जो बहुत ही कम संसाधन वाला और लागत-कुशल है। इसके अलावा, चुंबकीय मनका निष्कर्षण विधियों में अपकेंद्रित्र चरण शामिल नहीं होते हैं जो कतरनी बलों का कारण बन सकते हैं जो डीएनए के लंबे टुकड़ों को तोड़ देते हैं। इसका मतलब है कि डीएनए की लंबी किस्में बरकरार रहती हैं, जो जीनोमिक्स परीक्षण में महत्वपूर्ण है।