अपनी पीसीआर प्रतिक्रिया में हमें कितना टेम्पलेट जोड़ना चाहिए?

भले ही सिद्धांत रूप में, टेम्पलेट का एक अणु पर्याप्त होगा, काफी बड़ी मात्रा में डीएनए का उपयोग आमतौर पर एक क्लासिक पीसीआर के लिए किया जाता है, उदाहरण के लिए, जीनोमिक स्तनधारी डीएनए के 1 माइक्रोग्राम तक और प्लास्मिड डीएनए के 1 पीजी के रूप में कम। इष्टतम राशि काफी हद तक लक्ष्य अनुक्रम की प्रतियों की संख्या पर निर्भर करती है, साथ ही साथ इसकी जटिलता पर भी।

यदि बहुत कम टेम्पलेट का उपयोग किया जाता है, तो पर्याप्त मात्रा में उत्पाद प्राप्त करने के लिए प्रवर्धन चक्रों की संख्या में एक समान वृद्धि की आवश्यकता होगी। एक TAQ पोलीमरेज़ जो अधिकांश पीसीआर प्रयोगों के लिए उपयोग किया जाता है, में एक सुधार फ़ंक्शन (3′-5 ′ एक्सोन्यूक्लिज़ गतिविधि) की सुविधा नहीं होती है; इस प्रकार, प्रवर्धन के दौरान होने वाली त्रुटियों को ठीक नहीं किया जा सकता है। चक्रों की संख्या जितनी अधिक होगी, दोषपूर्ण उत्पाद का प्रवर्धन उतना ही अधिक प्रचलित होगा। यदि, दूसरी ओर, टेम्पलेट की मात्रा बहुत अधिक है, तो प्राइमरों की संभावना अन्य (एक सौ प्रतिशत मानार्थ नहीं) अनुक्रमों के साथ -साथ प्राइमर डिमर्स के गठन की संभावना बढ़ जाएगी, जिसके परिणामस्वरूप प्रवर्धन होगा उप-उत्पाद। कई मामलों में, डीएनए को सेल संस्कृतियों या सूक्ष्मजीवों से अलग किया जाता है और बाद में पीसीआर टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया जाता है। शुद्धिकरण के बाद, पीसीआर सेटअप के लिए आवश्यक मात्रा को परिभाषित करने में सक्षम होने के लिए डीएनए की एकाग्रता को निर्धारित करना आवश्यक है। जबकि agarose gel वैद्युतकणसंचलन एक अनुमान प्रदान करने के लिए काम कर सकता है, यह विधि सटीक से दूर है। यूवी-विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री को न्यूक्लिक एसिड की मात्रा का ठहराव के लिए सोने के मानक के रूप में स्थापित किया गया है; यह प्रत्यक्ष और इसलिए आसान और त्वरित विधि 260 एनएम पर नमूने के अवशोषण को मापती है, और एकाग्रता की गणना एक रूपांतरण कारक की मदद से की जाती है।

यदि डीएनए एकाग्रता बहुत कम है, हालांकि (<1 μg/ml dsDNA), या यदि यह उन पदार्थों से दूषित है जो 260 एनएम रेंज (जैसे आरएनए, प्रोटीन, लवण) में भी अवशोषित करते हैं, तो यह विधि अपनी सीमाओं तक पहुंच जाएगी। बहुत कम सांद्रता के मामले में, रीडिंग जल्द ही उपयोग के लिए बहुत गलत हो जाएगी, और संदूषण वास्तविक मूल्य के (कभी -कभी विशाल) overestimation हो जाएगा। इस मामले में, प्रतिदीप्ति का उपयोग करके परिमाणीकरण एक विकल्प प्रस्तुत कर सकता है। यह तकनीक एक फ्लोरोसेंट डाई के उपयोग पर आधारित है जो विशेष रूप से DSDNA को बांधती है, जिसमें केवल न्यूक्लिक एसिड और डाई शामिल जटिल होता है, जो प्रकाश से उत्साहित होता है, और यह बाद में थोड़ा अधिक तरंग दैर्ध्य के प्रकाश का उत्सर्जन करेगा। यहां, फ्लोरोसेंट सिग्नल की तीव्रता डीएनए की मात्रा के लिए आनुपातिक है, और एक सांद्रता का निर्धारण करने के लिए इसका मूल्यांकन एक मानक वक्र के संबंध में किया जाता है। इस पद्धति के फायदे बॉन्ड की विशिष्टता पर आराम करते हैं, जो संदूषण द्वारा पेश किए गए बाहरी प्रभावों को बाहर करता है, साथ ही साथ डीएनए की बहुत कम सांद्रता का पता लगाने की क्षमता पर भी। किसी भी विधि की उपयुक्तता मुख्य रूप से नमूना एकाग्रता और पवित्रता पर निर्भर करती है; कई मामलों में समानांतर में दोनों तरीकों को लागू करने की सलाह दी जा सकती है।