हमें अपने पीसीआर रिएक्शन में कितना टेम्पलेट जोड़ना चाहिए?

हालांकि सिद्धांत रूप में, टेम्पलेट का एक अणु पर्याप्त होगा, आमतौर पर क्लासिक पीसीआर के लिए काफी बड़ी मात्रा में डीएनए का उपयोग किया जाता है, उदाहरण के लिए, 1 माइक्रोग्राम तक जीनोमिक स्तनधारी डीएनए और कम से कम 1 पीजी प्लास्मिड डीएनए। इष्टतम राशि काफी हद तक लक्ष्य अनुक्रम की प्रतियों की संख्या, साथ ही इसकी जटिलता पर निर्भर करती है।

यदि बहुत कम टेम्पलेट का उपयोग किया जाता है, तो पर्याप्त मात्रा में उत्पाद प्राप्त करने के लिए प्रवर्धन चक्रों की संख्या में इसी वृद्धि की आवश्यकता होगी। अधिकांश पीसीआर प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले टाक पोलीमरेज़ में सुधार फ़ंक्शन (3′-5′ एक्सोन्यूक्लिज़ गतिविधि) की सुविधा नहीं होती है; इस प्रकार, प्रवर्धन के दौरान होने वाली त्रुटियों को ठीक नहीं किया जा सकता है। चक्रों की संख्या जितनी अधिक होगी, त्रुटिपूर्ण उत्पाद का प्रवर्धन उतना ही अधिक होगा। दूसरी ओर, यदि टेम्प्लेट की मात्रा बहुत अधिक है, तो प्राइमर के अन्य (सौ प्रतिशत मानार्थ नहीं) अनुक्रमों में शामिल होने की संभावना, साथ ही प्राइमर डिमर के गठन में वृद्धि होगी, जिसके परिणामस्वरूप प्रवर्धन होगा उपोत्पाद. कई मामलों में, डीएनए को कोशिका संवर्धन या सूक्ष्मजीवों से अलग किया जाता है और बाद में पीसीआर टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया जाता है। शुद्धिकरण के बाद, पीसीआर सेटअप के लिए आवश्यक मात्रा को परिभाषित करने में सक्षम होने के लिए डीएनए की एकाग्रता निर्धारित करना आवश्यक है। जबकि एगरोज़ जेल वैद्युतकणसंचलन एक अनुमान प्रदान करने के लिए काम कर सकता है, यह विधि सटीक से बहुत दूर है। यूवी-विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री को न्यूक्लिक एसिड की मात्रा निर्धारित करने के लिए स्वर्ण मानक के रूप में स्थापित किया गया है; यह प्रत्यक्ष और इसलिए आसान और त्वरित विधि 260 एनएम पर नमूने के अवशोषण को मापती है, और एकाग्रता की गणना एक रूपांतरण कारक की मदद से की जाती है।

यदि डीएनए सांद्रता बहुत कम है, हालांकि (<1 μg/mL dsDNA), या यदि यह उन पदार्थों से दूषित है जो 260 एनएम रेंज (जैसे आरएनए, प्रोटीन, लवण) में भी अवशोषित होते हैं, तो यह विधि अपनी सीमाओं तक पहुंच जाएगी। बहुत कम सांद्रता के मामले में, रीडिंग जल्द ही उपयोग के लिए बहुत गलत हो जाएगी, और संदूषण के कारण वास्तविक मूल्य का (कभी-कभी बहुत अधिक) अधिक आकलन हो जाएगा। इस मामले में, प्रतिदीप्ति का उपयोग करके परिमाणीकरण एक विकल्प प्रस्तुत कर सकता है। यह तकनीक एक फ्लोरोसेंट डाई के उपयोग पर आधारित है जो विशेष रूप से डीएसडीएनए से जुड़ती है, केवल न्यूक्लिक एसिड और डाई युक्त कॉम्प्लेक्स प्रकाश से उत्तेजित होता है, और यह बाद में थोड़ा अधिक तरंग दैर्ध्य का प्रकाश उत्सर्जित करेगा। यहां, फ्लोरोसेंट सिग्नल की तीव्रता डीएनए की मात्रा के समानुपाती होती है, और एकाग्रता निर्धारित करने के लिए इसका मूल्यांकन एक मानक वक्र के संबंध में किया जाता है। इस पद्धति के फायदे बंधन की विशिष्टता पर निर्भर हैं, जो संदूषण द्वारा उत्पन्न बाहरी प्रभावों को शामिल नहीं करता है, साथ ही डीएनए की बहुत कम सांद्रता का पता लगाने की परिणामी क्षमता पर भी निर्भर करता है। किसी भी विधि की उपयुक्तता मुख्य रूप से नमूना एकाग्रता और शुद्धता पर निर्भर करती है; कई मामलों में दोनों विधियों को समानांतर रूप से लागू करने की भी सलाह दी जा सकती है।