ʻOiai ma ke kumumanaʻo, lawa ka mole o ka template, hoʻohana maʻamau ka nui o ka DNA no kahi PCR maʻamau, no ka laʻana, a hiki i ka 1 µg o ka DNA mammalian genomic a me ka liʻiliʻi o 1 pg o plasmid DNA. ʻO ka nui maikaʻi loa e hilinaʻi nui ʻia ma ka helu o nā kope o ke kaʻina pahuhopu, a me kona paʻakikī.
Inā hoʻohana ʻia ka laʻana liʻiliʻi, pono ka hoʻonui ʻana i ka nui o nā pōʻai hoʻonui e loaʻa ai ka nui o ka huahana. ʻO Taq polymerase i hoʻohana ʻia no ka hapa nui o nā hoʻokolohua PCR ʻaʻole i loaʻa kahi hana hoʻoponopono (3′-5′ exonuclease activity); no laila, ʻaʻole hiki ke hoʻoponopono ʻia nā hewa i ka wā hoʻonui. ʻOi aku ka kiʻekiʻe o ka helu o nā pōʻai, ʻoi aku ka nui o ka hoʻonui ʻia o ka huahana flawed. Inā, ma kekahi ʻaoʻao, ʻoi aku ka kiʻekiʻe o ka nui o ka template, e hoʻonui ʻia ka nui o nā primers annealing i nā ʻāpana ʻē aʻe (ʻaʻole hoʻokahi haneli pākēneka), a me ka hoʻokumu ʻana i nā dimer primer, e hoʻonui ʻia, e hopena i ka amplification o nā huahana. I nā manawa he nui, ua hoʻokaʻawale ʻia ʻo DNA mai nā moʻomeheu cell a i ʻole nā microorganisms a laila hoʻohana ʻia ma ke ʻano he PCR template. Ma hope o ka hoʻomaʻemaʻe ʻana, pono e hoʻoholo i ka neʻe ʻana o ka DNA e hiki ke wehewehe i ka leo e pono ai no ka hoʻonohonoho PCR. ʻOiai hiki ke hāʻawi i ka electrophoresis gel agarose e hāʻawi i kahi kuhi, ʻaʻole mamao kēia ʻano mai ka pololei. Ua hoʻokumu ʻia ka spectrophotometry UV-Vis e like me ke kūlana gula no ka helu ʻana i nā waikawa nucleic; ʻO kēia ala pololei a no laila maʻalahi a wikiwiki hoʻi e ana i ka absorbance o ka hāpana ma 260 nm, a helu ʻia ka ʻike me ke kōkua o kahi mea hoʻololi.
Inā he haʻahaʻa loa ka ʻike DNA, akā naʻe (< 1 µg/mL dsDNA), a inā ua haumia ʻia me nā mea i komo pū i loko o ka laulā 260 nm (e laʻa me RNA, protein, paʻakai), hiki i kēia ala i kona palena. Inā he haʻahaʻa haʻahaʻa loa, ʻaʻole pololei loa ka heluhelu ʻana no ka hoʻohana ʻana, a e alakaʻi ʻia nā mea haumia i (kekahi manawa nui) i ka manaʻo nui o ka waiwai maoli. I kēia hihia, hiki i ka helu ʻana me ka fluorescence ke hōʻike i kahi ʻano ʻē aʻe. Hoʻokumu ʻia kēia ʻano hana ma ka hoʻohana ʻana i kahi mea hoʻoheheʻe fluorescent e hoʻopaʻa pono i ka dsDNA wale nō ka paʻakikī me ka waika nucleic a me ka wai i hoʻohauʻoli ʻia e ke kukui, a laila e hoʻopuka i ka mālamalama o kahi lōʻihi haʻahaʻa iki. Maʻaneʻi, ua like ka ikaika o ka hōʻailona fluorescent i ka nui o ka DNA, a no ka hoʻoholoʻana i ka manaʻo e loiloiʻia e pili ana i kahi pale maʻamau. ʻO nā mea maikaʻi o kēia ʻano hana e pili ana i ka kikoʻī o ka paʻa, kahi e kāpae ʻia ai nā mana o waho i hoʻokomo ʻia e ka contamination, a me ka hiki ke ʻike i nā haʻahaʻa haʻahaʻa o DNA. ʻO ke kūpono o kēlā me kēia ala e hilinaʻi nui ʻia i ka hoʻohālikelike ʻana a me ka maʻemaʻe; I nā manawa he nui, pono paha e hoʻohana like i nā ʻano ʻelua.
Ka manawa hoʻouna: Nov-30-2022