મારી પીસીઆર પ્રતિક્રિયામાં આપણે કેટલો ટેમ્પલેટ ઉમેરવો જોઈએ?

સૈદ્ધાંતિક રીતે, ટેમ્પલેટનો એક પરમાણુ પર્યાપ્ત હોવા છતાં, સામાન્ય રીતે ક્લાસિક પીસીઆર માટે ડીએનએના નોંધપાત્ર પ્રમાણમાં મોટા પ્રમાણમાં ઉપયોગ થાય છે, ઉદાહરણ તરીકે, 1 µg જીનોમિક સસ્તન ડીએનએ અને પ્લાઝમિડ ડીએનએના 1 પીજી જેટલું ઓછું. શ્રેષ્ઠ રકમ મોટે ભાગે લક્ષ્ય ક્રમની નકલોની સંખ્યા તેમજ તેની જટિલતા પર આધારિત છે.

જો ખૂબ જ ઓછા નમૂનાનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે, તો ઉત્પાદનની પૂરતી માત્રા મેળવવા માટે એમ્પ્લીફિકેશન ચક્રની સંખ્યામાં અનુરૂપ વધારાની જરૂર પડશે. મોટાભાગના પીસીઆર પ્રયોગો માટે ઉપયોગમાં લેવાતા Taq પોલિમરેઝમાં સુધારણા કાર્ય (3′-5′ exonuclease પ્રવૃત્તિ) દર્શાવવામાં આવતી નથી; આમ, એમ્પ્લીફિકેશન દરમિયાન થતી ભૂલોને સુધારી શકાતી નથી. ચક્રની સંખ્યા જેટલી વધુ હશે, ખામીયુક્ત ઉત્પાદનનું એમ્પ્લીફિકેશન વધુ પ્રચલિત હશે. જો, બીજી બાજુ, ટેમ્પ્લેટની માત્રા ખૂબ વધારે હોય, તો અન્ય (સો ટકા સ્તુત્ય નહીં) સિક્વન્સમાં પ્રાઈમર્સની એનિલિંગની સંભાવના, તેમજ પ્રાઈમર ડાઇમર્સની રચનામાં વધારો થશે, જેના પરિણામે એમ્પ્લીફિકેશન થશે. આડપેદાશો. ઘણા કિસ્સાઓમાં, ડીએનએ સેલ કલ્ચર અથવા સુક્ષ્મસજીવોમાંથી અલગ કરવામાં આવે છે અને ત્યારબાદ પીસીઆર ટેમ્પલેટ તરીકે ઉપયોગમાં લેવાય છે. શુદ્ધિકરણ પછી, પીસીઆર સેટઅપ માટે જરૂરી વોલ્યુમને વ્યાખ્યાયિત કરવામાં સક્ષમ થવા માટે ડીએનએની સાંદ્રતા નક્કી કરવી જરૂરી છે. જ્યારે એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ અંદાજ પૂરો પાડવા માટે સેવા આપી શકે છે, આ પદ્ધતિ સચોટ નથી. યુવી-વિસ સ્પેક્ટ્રોફોટોમેટ્રીને ન્યુક્લીક એસિડના પરિમાણ માટે સુવર્ણ ધોરણ તરીકે સ્થાપિત કરવામાં આવ્યું છે; આ સીધી અને તેથી સરળ અને ઝડપી પદ્ધતિ 260 nm પર નમૂનાના શોષણને માપે છે, અને એકાગ્રતા રૂપાંતરણ પરિબળની મદદથી ગણવામાં આવે છે.

જો DNA સાંદ્રતા ખૂબ ઓછી હોય, તેમ છતાં (< 1 µg/mL dsDNA), અથવા જો તે એવા પદાર્થોથી દૂષિત હોય જે 260 nm શ્રેણીમાં પણ શોષાય છે (દા.ત. RNA, પ્રોટીન, ક્ષાર), તો આ પદ્ધતિ તેની મર્યાદાઓ સુધી પહોંચી જશે. ખૂબ ઓછી સાંદ્રતાના કિસ્સામાં, વાંચન ટૂંક સમયમાં ઉપયોગ માટે ખૂબ જ અચોક્કસ બની જશે, અને દૂષણો વાસ્તવિક મૂલ્યના (ક્યારેક પ્રચંડ) અતિશય અંદાજ તરફ દોરી જશે. આ કિસ્સામાં, ફ્લોરોસેન્સનો ઉપયોગ કરીને પ્રમાણીકરણ વૈકલ્પિક રજૂ કરી શકે છે. આ ટેકનીક ફ્લોરોસન્ટ ડાઈના ઉપયોગ પર આધારિત છે જે ખાસ કરીને dsDNA સાથે જોડાય છે માત્ર ન્યુક્લીક એસિડ અને ડાયનો સમાવેશ કરેલો કોમ્પ્લેક્સ પ્રકાશથી ઉત્તેજિત થાય છે અને તે પછીથી થોડી વધારે તરંગલંબાઈનો પ્રકાશ બહાર કાઢશે. અહીં, ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલની તીવ્રતા ડીએનએના જથ્થાના પ્રમાણસર છે, અને સાંદ્રતા નક્કી કરવા માટે તેનું મૂલ્યાંકન પ્રમાણભૂત વળાંકના સંબંધમાં કરવામાં આવે છે. આ પદ્ધતિના ફાયદા બોન્ડની વિશિષ્ટતા પર આધાર રાખે છે, જે દૂષિતતા દ્વારા રજૂ કરાયેલા બાહ્ય પ્રભાવોને બાકાત રાખે છે, તેમજ ડીએનએની ખૂબ ઓછી સાંદ્રતા શોધવાની પરિણામી ક્ષમતા પર. કોઈપણ પદ્ધતિની યોગ્યતા મુખ્યત્વે નમૂનાની સાંદ્રતા અને શુદ્ધતા પર આધારિત છે; ઘણા કિસ્સાઓમાં બંને પદ્ધતિઓ સમાંતર લાગુ કરવાની સલાહ પણ આપવામાં આવે છે.