Para reaccións de amplificación exitosas, é necesario que os compoñentes de reacción individuais estean presentes na concentración correcta en cada preparación. Ademais, é importante que non se produza contaminación.
Especialmente cando hai que configurar moitas reaccións, estableceuse para preparar unha chamada mestura mestra en lugar de canalizar cada reactivo por separado en cada vaso. As mesturas pre-configuradas están dispoñibles comercialmente, nas que só se engaden compoñentes específicos da mostra (cebador) e auga. Alternativamente, a mestura mestra pódese preparar por ti mesmo. En ambas as variantes, a mestura distribúese a cada vaso de PCR sen plantilla e a mostra de ADN individual engádese por separado ao final.
Usar unha mestura mestra ten varias vantaxes: en primeiro lugar, redúcese o número de pasos de canalización única. Deste xeito, tanto o risco de erros do usuario durante a canalización como o risco de contaminación minimízanse e, por suposto, afórrase o tempo. En principio, a precisión de canalización tamén é maior, xa que os volumes máis grandes son dosificados. Isto é fácil de entender ao comprobar os datos técnicos das pipetas: canto menor sexa o volume dosificado, máis poderán ser as desviacións. O feito de que todos os preparativos procedan da mesma embarcación ten un efecto positivo na homoxeneidade (se está ben mesturado). Isto tamén mellora a reproducibilidade dos experimentos.
Ao preparar a mestura mestra, debería engadirse polo menos un 10 % de volume adicional (por exemplo, se se precisan 10 preparacións, calcula con base en 11), de xeito que incluso o último buque se enche correctamente. Deste xeito, pódense compensar (leve) imprecisións de canalización e o efecto da perda de mostras ao dosificar solucións que conteñen deterxente. Os deterxentes están contidos en solucións enzimáticas como polimerases e mesturas, provocando formación de escuma e residuos na superficie interior do normalConsellos de pipeta.
Dependendo da aplicación e do tipo de líquido a dispensar, debe escollerse a técnica de canalización correcta (1) e seleccionar o equipo adecuado. Para solucións que conteñen deterxentes, un sistema de desprazamento directo ou os chamados consellos de pipeta de "baixa retención" como alternativa para as pipetas de coxíns. O efecto deConsello de pipetabaséase nunha superficie especialmente hidrofóbica. Os líquidos que conteñen deterxentes non deixan unha película de residuos por dentro e fóra, de xeito que se pode minimizar a perda de solución.
Ademais da dosificación exacta de todos os compoñentes, tamén é importante que non se produza contaminación dos preparativos. Non é suficiente usar consumibles de alta pureza, porque o proceso de canalización nunha pipeta de coxín de aire pode producir aerosois que quedan na pipeta. O ADN que pode estar contido no aerosol pódese transferir dunha mostra a outra no seguinte paso de canalización e levar así a contaminación. Os sistemas de desprazamento directo mencionados anteriormente tamén poden minimizar este risco. Para as pipetas do coxín de aire ten sentido usar consellos de filtro para protexer o cono de pipeta mantendo salpicaduras, aerosois e biomoléculas.
Tempo de publicación: decembro do 06-2022