Para as reaccións de amplificación exitosas, é necesario que os compoñentes individuais da reacción estean presentes na concentración correcta en cada preparación. Ademais, é importante que non se produza contaminación.
Especialmente cando hai que configurar moitas reaccións, estableceuse a preparación dunha chamada mestura principal en lugar de pipetear cada reactivo por separado en cada recipiente. Comercialmente están dispoñibles mesturas preconfiguradas, nas que só se engaden compoñentes específicos da mostra (primer) e auga. Alternativamente, a mestura principal pódese preparar por ti mesmo. En ambas as variantes, a mestura distribúese a cada recipiente de PCR sen plantilla e a mostra de ADN individual engádese por separado ao final.
Usar unha mestura mestra ten varias vantaxes: En primeiro lugar, redúcese o número de pasos únicos de pipeteo. Deste xeito, tanto o risco de erros do usuario durante o pipeteo como o risco de contaminación redúcense e, por suposto, aforrarase tempo. En principio, a precisión do pipeteo tamén é maior, xa que se dosifican volumes maiores. Isto é fácil de entender ao comprobar os datos técnicos das pipetas: canto menor sexa o volume dosificado, máis altas poden ser as desviacións. O feito de que todas as preparacións proveñan do mesmo recipiente ten un efecto positivo sobre a homoxeneidade (se se mesturan ben). Isto tamén mellora a reproducibilidade dos experimentos.
Ao preparar a mestura principal, debe engadirse polo menos un 10 % de volume extra (por exemplo, se se precisan 10 preparacións, calcule a partir de 11), de xeito que ata o último recipiente se enche correctamente. Deste xeito, pódense compensar as (lixeiras) imprecisións de pipeteo e o efecto da perda de mostra ao dosificar solucións que conteñan deterxentes. Os deterxentes están contidos en solucións enzimáticas como polimerases e mesturas principais, causando formación de escuma e residuos na superficie interna do normal.puntas de pipeta.
Dependendo da aplicación e do tipo de líquido que se vaia dispensar, debe escollerse a técnica de pipeteo correcta (1) e seleccionar o equipo axeitado. Para as solucións que conteñan deterxentes, recoméndase un sistema de desprazamento directo ou as chamadas puntas de pipeta de "baixa retención" como alternativa ás pipetas de colchón de aire. O efecto dePunta de PIPETA ACEbaséase nunha superficie especialmente hidrófoba. Os líquidos que conteñen deterxentes non deixan unha película de residuos no interior e no exterior, polo que se pode minimizar a perda de solución.
Ademais da dosificación exacta de todos os compoñentes, tamén é importante que non se produza contaminación dos preparados. Non é suficiente empregar consumibles de alta pureza, porque o proceso de pipeteo nunha pipeta de colchón de aire pode producir aerosois que permanecen na pipeta. O ADN que pode estar contido no aerosol pódese transferir dunha mostra a outra no seguinte paso de pipeteo e, polo tanto, provocar contaminación. Os sistemas de desprazamento directo mencionados anteriormente tamén poden minimizar este risco. Para as pipetas con almofada de aire ten sentido usar puntas de filtro para protexer o cono da pipeta retendo salpicaduras, aerosois e biomoléculas.
Hora de publicación: Dec-06-2022