Crioviaisúsanse habitualmente para o almacenamento crioxénico de liñas celulares e outros materiais biolóxicos críticos, en dewars cheos de nitróxeno líquido.

Hai varias etapas implicadas na conservación exitosa das células en nitróxeno líquido. Aínda que o principio básico é unha conxelación lenta, a técnica exacta empregada depende do tipo celular e do crioprotector utilizado. Hai varias consideracións de seguridade e boas prácticas a ter en conta ao almacenar as celas a temperaturas tan baixas.

Esta publicación ten como obxectivo dar unha visión xeral de como se almacenan os crioviais en nitróxeno líquido.

Que son os crioviais

Os crioviais son frascos pequenos con tapa deseñados para almacenar mostras líquidas a temperaturas extremadamente baixas. Aseguran que as células conservadas en crioprotector non entren en contacto directo co nitróxeno líquido, minimizando o risco de fracturas celulares aínda que se benefician do efecto de arrefriamento extremo do nitróxeno líquido.

Os frascos adoitan estar dispoñibles nunha variedade de volumes e deseños: poden ser roscados internamente ou externamente con fondos planos ou redondeados. Tamén están dispoñibles os formatos estériles e non estériles.

Quen usaCyrovialspara almacenar células en nitróxeno líquido

Unha serie de laboratorios privados e do NHS, así como institucións de investigación especializadas en bancos de sangue do cordón umbilical, bioloxía de células epiteliais, inmunoloxía e bioloxía de células nai usan crioviais para criopreservar as células.

As células conservadas deste xeito inclúen as células B e T, as células CHO, as células nai hematopoyéticas e as células proxenitoras, os hibridomas, as células intestinais, os macrófagos, as células nai mesenquimales e as células proxenitoras, os monocitos, o mieloma, as células NK e as células nai pluripotentes.

Visión xeral de como almacenar crioviais en nitróxeno líquido

A criopreservación é un proceso que preserva as células e outras construcións biolóxicas arrefriándoas a temperaturas moi baixas. As células pódense almacenar en nitróxeno líquido durante anos sen perda de viabilidade celular. Este é un esquema dos procedementos empregados.

Preparación celular

O método exacto para preparar as mostras variará dependendo do tipo de célula, pero en xeral, as células recóllense e centrifúganse para desenvolver un sedimento rico en células. Este sedimento resuspéndese despois no sobrenadante mesturado con crioprotector ou cun medio de criopreservación.

Medio de criopreservación

Este medio emprégase para preservar as células nos ambientes de baixa temperatura aos que serán sometidas inhibindo a formación de cristais intra e extracelulares e, polo tanto, a morte celular. O seu papel é proporcionar un ambiente seguro e protector para as células e os tecidos durante os procesos de conxelación, almacenamento e desconxelación.

Mestúrase un medio como plasma fresco conxelado (FFP), solución de plasmalito heparinizado ou solucións sen soro e sen compoñentes animais con crioprotectores como dimetilsulfóxido (DMSO) ou glicerol.

O gránulo de mostra re-licuado é alícuotado en crioviales de polipropileno comoCompañía biomédica Suzhou Ace Vials de almacenamento criogénico.

É importante non encher os crioviais en exceso xa que isto aumentará o risco de rachadura e a posible liberación de contidos (1).

Taxa de conxelación controlada

En xeral, úsase unha taxa de conxelación controlada lenta para a criopreservación exitosa das células.

Despois de que as mostras sexan alícuotas en frascos crioxénicos, colócanse sobre xeo húmido ou nunha neveira a 4 ℃ e o procedemento de conxelación comeza en 5 minutos. Como guía xeral, as células arrefríanse a un ritmo de -1 a -3 por minuto (2). Isto conséguese mediante un refrixerador programable ou colocando frascos nunha caixa illada colocada nun conxelador a velocidade controlada entre -70 °C e -90 °C.

Transferencia a nitróxeno líquido

A continuación, os frascos crioxénicos conxelados transfírense a un tanque de nitróxeno líquido durante períodos indefinidos sempre que se manteña unha temperatura inferior a -135 ℃.

Estas temperaturas ultra baixas pódense obter por inmersión no nitróxeno en fase líquida ou vapor.

Fase líquida ou vapor?

Sábese que o almacenamento en nitróxeno en fase líquida mantén a temperatura fría con consistencia absoluta, pero moitas veces non se recomenda polas seguintes razóns:

• A necesidade de grandes volumes (profundidade) de nitróxeno líquido que é un perigo potencial. As queimaduras ou asfixia por iso é un risco real.
• Casos documentados de contaminación cruzada por axentes infecciosos como aspergillus, hep B e propagación viral a través do medio de nitróxeno líquido (2,3)
• O potencial de filtración de nitróxeno líquido nos frascos durante a inmersión. Cando se retira do almacenamento e se quenta a temperatura ambiente, o nitróxeno se expande rapidamente. En consecuencia, o frasco pode romperse cando se retira do almacenamento de nitróxeno líquido, creando un perigo tanto polos restos voadores como pola exposición ao contido (1, 4).

Por estes motivos, o almacenamento a temperatura ultra baixa é máis comúnmente en nitróxeno en fase de vapor. Cando as mostras se deben almacenar en fase líquida, debe utilizarse tubos cryoflex especializados.

A desvantaxe da fase de vapor é que pode ocorrer un gradiente de temperatura vertical que provoca flutuacións de temperatura entre -135 ℃ e -190 ℃. Isto require un seguimento coidadoso e dilixente dos niveis de nitróxeno líquido e das variacións de temperatura (5).

Moitos fabricantes recomendan que os crioviais sexan axeitados para almacenar ata -135 ℃ ou só para usar na fase de vapor.

Desconxelar as túas células criopreservadas

O procedemento de desconxelación é estresante para un cultivo conxelado, e é necesario un manexo e unha técnica adecuadas para garantir unha viabilidade, recuperación e funcionalidade óptimas das células. Os protocolos de desconxelación exactos dependerán de tipos específicos de células. Non obstante, a desconxelación rápida considérase estándar para:

• Diminúe calquera impacto na recuperación celular
• Axuda a reducir o tempo de exposición aos solutos presentes nos medios de conxelación
• Minimizar calquera dano pola recristalización do xeo

Os baños de auga, os baños de perlas ou os instrumentos automatizados especializados úsanse habitualmente para desconxelar mostras.

O máis frecuente é desconxelar 1 liña celular á vez durante 1-2 minutos, xirando suavemente nun baño de auga a 37 ℃ ata que quede só un pouco de xeo no frasco antes de lavar nun medio de crecemento prequente.

Para algunhas células, como os embrións de mamíferos, o quecemento lento é esencial para a súa supervivencia.

As células xa están listas para o cultivo celular, o illamento celular ou, no caso das células nai hematopoyéticas, estudos de viabilidade para garantir a integridade das células nai doadores antes da terapia mieloablativa.

É unha práctica normal tomar pequenas alícuotas da mostra prelavada utilizada para realizar un reconto celular para determinar as concentracións celulares para o cultivo en placas. Despois pode avaliar os resultados dos procedementos de illamento celular e determinar a viabilidade celular.

Mellores prácticas para o almacenamento de crioviais

A criopreservación exitosa das mostras almacenadas en crioviais depende de moitos elementos do protocolo, incluíndo o almacenamento e o mantemento adecuados de rexistros.

• Divide as celas entre os lugares de almacenamento– Se os volumes o permiten, divida as células entre os frascos e gárdaas en lugares separados para reducir o risco de perda de mostras debido a fallos dos equipos.
• Evitar a contaminación cruzada– Optar por frascos crioxénicos estériles dun só uso ou autoclave antes do seu uso posterior
• Use frascos do tamaño adecuado para as súas células– Os frascos teñen un rango de volumes entre 1 e 5 ml. Evite encher os frascos en exceso para reducir o risco de rachaduras.
• Seleccione frascos criogénicos con rosca interna ou externa– Algunhas universidades recomendan os frascos con rosca interna como medidas de seguridade; tamén poden evitar a contaminación durante o enchido ou cando se almacenan no nitróxeno líquido.
• Evitar fugas- Use selos bi-inxectados moldeados na tapa de rosca ou nas juntas tóricas para evitar fugas e contaminación.
• Use códigos de barras 2D e viales de etiquetas– Para garantir a trazabilidade, os frascos con grandes superficies de escritura permiten que cada vial estea adecuadamente etiquetado. Os códigos de barras 2D poden axudar na xestión do almacenamento e no mantemento de rexistros. As tapas codificadas por cores son útiles para facilitar a identificación.
• Mantemento adecuado do almacenamento- Para garantir que as células non se perdan, os recipientes de almacenamento deben controlar constantemente a temperatura e os niveis de nitróxeno líquido. Deben instalarse alarmas para alertar aos usuarios dos erros.

Precaucións de seguridade

O nitróxeno líquido converteuse nunha práctica común na investigación moderna, pero conleva o risco de lesións graves se se usa incorrectamente.

Debe levarse un equipo de protección individual (EPI) adecuado para minimizar o risco de conxelación, queimaduras e outros incidentes adversos ao manipular nitróxeno líquido. Desgaste

• Luvas crioxénicas
• Bata de laboratorio
• Pantalla facial completa resistente a impactos que tamén cobre o pescozo
• Zapatos pechados
• Delantal de plástico a proba de salpicaduras

Os frigoríficos de nitróxeno líquido deben colocarse en áreas ben ventiladas para minimizar o risco de asfixia: o nitróxeno escapado vaporízase e despraza o osíxeno atmosférico. As tendas de gran volume deberían ter sistemas de alarma de baixo osíxeno.

Traballar en parella cando se manipula nitróxeno líquido é ideal e debe prohibirse o seu uso fóra do horario normal de traballo.

Crioviais para apoiar o seu fluxo de traballo

A empresa Suzhou Ace Biomedical ofrece unha ampla selección de produtos que satisfacen as súas necesidades de criopreservación para diferentes tipos de células. A carteira inclúe unha gama de tubos, así como unha gama de crioviales estériles.

Os nosos crioviais son:

• Tapón de rosca de laboratorio 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml Viales criogénicos crioviales Criotubo de fondo cónico con junta

  ● Especificación de 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, con saia ou sen saia
  ● Dispón de deseño cónico ou autoportante, estériles ou non estériles
  ● Os tubos de tapón de rosca están feitos de polipropileno de grao médico
  ● Os frascos de criotubos de PP pódense conxelar e desconxelar repetidamente
  ●O deseño da tapa externa pode reducir a probabilidade de contaminación durante o tratamento da mostra.
  ● Tubos crioxénicos con tapón de rosca Roscas universais de uso
  ● Os tubos encaixan na maioría dos rotores comúns
  ● Os tubos de junta tórica de tubo crioxénico encaixan en caixas de conxelación estándar de 1 polgada e 2 polgadas, 48 ​​pozos, 81 pozos, 96 pozos e 100 pozos.
  ● Autoclavable ata 121 °C e conxelable ata -86 °C

  PARTE NO	MATERIAIS	VOLUME	CAPCOR	PCS/BOLSA	BOLSAS/CASA
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Negro, Amarelo, Azul, Vermello, Roxo, Branco	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Negro, Amarelo, Azul, Vermello, Roxo, Branco	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Negro, Amarelo, Azul, Vermello, Roxo, Branco	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Negro, Amarelo, Azul, Vermello, Roxo, Branco	500	10