A estandarización dos procesos inclúe a súa optimización e o posterior establecemento e harmonización, permitindo un rendemento óptimo a longo prazo, independentemente do usuario. A estandarización garante resultados de alta calidade, así como a súa reproducibilidade e comparabilidade.
O obxectivo da PCR (clásica) é a xeración dun resultado fiable e reproducible. Para determinadas aplicacións, o rendemento doProduto de PCRtamén é relevante. Para estas reaccións, hai que ter coidado para garantir que as mostras non se vexan comprometidas e que o fluxo de traballo da PCR se manteña estable. Concretamente, isto tradúcese en minimizar a introdución de contaminacións que poidan dar lugar a resultados falsos positivos ou falsos negativos ou mesmo inhibir a reacción da PCR. Ademais, as condicións de reacción deben ser o máis idénticas posible para cada mostra individual dentro dunha carreira e tamén ser transferibles ás reaccións posteriores (do mesmo método). Isto refírese á composición das reaccións así como ao tipo de control de temperatura no ciclador. Os erros dos usuarios, por suposto, deben evitarse na medida do posible.
A continuación, demostraremos os desafíos que se atopan durante a preparación e durante a execución dunha PCR, e os enfoques das solucións existentes con respecto aos instrumentos e consumibles utilizados para a estandarización dos fluxos de traballo da PCR.
Preparación da reacción
A dispensación de compoñentes de reacción en recipientes de PCR ou placas, respectivamente, comprende múltiples desafíos que deben superarse:
Condicións de reacción
A dosificación exacta e precisa dos compoñentes individuais é indispensable cando se pretende conseguir as condicións de reacción máis idénticas posibles. Ademais dunha boa técnica de pipeteo, é fundamental seleccionar a ferramenta correcta. As mesturas mestras de PCR conteñen frecuentemente substancias que aumentan a viscosidade ou xeran escuma. Durante o proceso de pipeteo, estes levan a unha humectación substancial dopuntas de pipeta, reducindo así a precisión do pipeteo. O uso de sistemas de dispensación directa ou puntas de pipeta alternativas que sexan menos propensas a mollarse pode mellorar a exactitude e precisión do proceso de pipeteo.
Contaminacións
Durante o proceso de dispensación, xéranse aerosois que, se se deixan chegar ao interior da pipeta, poden potencialmente contaminar outra mostra durante o seguinte paso de pipeteo. Isto pódese evitar usando puntas de filtro ou sistemas de desprazamento directo.
Consumibles comoconsellos, os recipientes e placas que se utilizan no fluxo de traballo da PCR non deben conter substancias que comprometan a mostra ou falsifiquen o resultado. Estes inclúen ADN, ADNases, RNases e inhibidores da PCR, así como compoñentes que poden filtrarse do material durante a reacción: substancias coñecidas como lixiviables.
Erro do usuario
Cantas máis mostras se procesen, maior será o risco de erro. Pode ocorrer facilmente que se pipetee unha mostra no recipiente incorrecto ou no pozo incorrecto. Este risco pode reducirse considerablemente mediante un marcado facilmente discernible dos pozos. Mediante a automatización dos pasos de dispensación, minimizan o “factor humano”, é dicir, os erros e as variacións relacionadas co usuario, aumentando así a reproducibilidade, especialmente no caso de pequenos volumes de reacción. Isto require placas de suficiente estabilidade dimensional para ser empregadas nunha estación de traballo. Os códigos de barras adxuntos proporcionan unha lectura adicional por máquina, o que simplifica o seguimento das mostras durante todo o proceso.
Programación do termociclador
Programar un instrumento pode resultar lento e propenso a erros. Diferentes funcións do termociclador PCR traballan en conxunto para simplificar este paso do proceso e, o máis importante, para facelo seguro:
O funcionamento sinxelo e unha boa orientación do usuario son a base dunha programación eficiente. Partindo desta base, a administración de usuarios protexidos con contrasinal evitará que os propios programas sexan alterados por outros usuarios. Se se usan varios cicladores (do mesmo tipo), é beneficioso que un programa se poida transferir directamente dun instrumento a outro mediante USB ou conectividade. O software informático permite a administración central e segura de programas, dereitos de usuario e documentos nun ordenador.
Execución de PCR
Durante a carreira, o ADN amplificase no recipiente de reacción, onde cada mostra debe someterse a condicións de reacción idénticas e consistentes. Os seguintes aspectos son relevantes para o proceso:
Control de temperatura
A excelente precisión no control da temperatura e a homoxeneidade do bloque ciclador son a base para un acondicionamento uniforme da temperatura de todas as mostras. A alta calidade dos elementos de calefacción e refrixeración (elementos peltier), así como a forma en que estes están conectados ao bloque, son os factores determinantes que determinarán o risco de discrepancias de temperatura coñecido como "efecto bordo".
Evaporación
As concentracións dos compoñentes individuais da reacción non deben cambiar ao longo da reacción debido á evaporación. Se non, é posible que moi poucoProduto de PCRpode ser xerado, ou ningún. Polo tanto, é fundamental minimizar a evaporación garantindo un selado seguro. Neste caso, a tapa quentada do termociclador e o selo do recipiente traballan da man. Hai diferentes opcións de selado dispoñibles paraPlacas de PCR (ligazón: artigo de selado), polo que o mellor selado conséguese mediante o termoselado. Tamén poden ser axeitados outros peches, sempre que a presión de contacto da tapa do ciclador se poida axustar ao selo seleccionado.
A estandarización do proceso está en vigor para garantir resultados precisos e reproducibles a longo prazo. Isto inclúe o mantemento regular do equipo para garantir que estea sempre en bo estado de funcionamento. Todos os consumibles deben ser de calidade constante en todos os lotes producidos e debe garantirse a súa dispoñibilidade fiable.
Hora de publicación: 29-nov-2022