Introdución
Que é a extracción de ácido nucleico?
No máis sinxelo dos termos, a extracción de ácido nucleico é a eliminación do ARN e/ou ADN dunha mostra e todo o exceso que non é necesario. O proceso de extracción illou os ácidos nucleicos dunha mostra e cóntanos en forma de eluato concentrado, libre de diluentes e contaminantes que poidan afectar as aplicacións descendentes.
Aplicacións de extracción de ácido nucleico
Os ácidos nucleicos purificados úsanse nunha infinidade de diferentes aplicacións, que abarcan en varias industrias diferentes. A asistencia sanitaria é quizais a área onde máis se usa, con ARN e ADN purificados necesarios para unha serie de diferentes fins de proba.
As aplicacións de extracción de ácido nucleico na asistencia sanitaria inclúen:
- secuenciación de próxima xeración (NGS)
- Xenotipado SNP baseado na amplificación
- Xenotipado baseado en matriz
- Dixestión de enzimas de restrición
- Analizacións mediante encimas modificadoras (por exemplo, ligación e clonación)
Tamén hai outros campos máis alá da asistencia sanitaria onde se usa a extracción de ácido nucleico, incluíndo pero non limitado a probas de paternidade, forenses e xenómica.
Unha breve historia da extracción de ácido nucleico
Extracción de ADNDates dun longo camiño, co primeiro illamento coñecido por ser realizado por un médico suízo chamado Friedrich Miescher en 1869. Miescher esperaba resolver os principios fundamentais da vida determinando a composición química das células. Despois de fallar con linfocitos, foi capaz de obter un precipitado bruto de ADN a partir de leucocitos atopados en pus en vendas descartadas. Fíxoo engadindo ácido e logo alcalino á célula para deixar o citoplasma da célula e logo desenvolveu un protocolo para separar o ADN das outras proteínas.
Despois da investigación innovadora de Miescher, moitos outros científicos pasaron a avanzar e desenvolver técnicas para illar e purificar o ADN. Edwin Joseph Cohn, un científico proteico desenvolveu moitas técnicas para a purificación de proteínas durante a Segunda Guerra Mundial. Foi o responsable de illar a fracción de albúmina sérica do plasma sanguíneo, o que é importante para manter a presión osmótica nos vasos sanguíneos. Isto foi crucial para manter vivo os soldados.
En 1953, Francis Crick, xunto con Rosalind Franklin e James Watson, determinaron a estrutura do ADN, demostrando que estaba formada por dúas cordas de longas cadeas de nucleótidos de ácido nucleico. Este descubrimento avanzado abriu o camiño para Meselson e Stahl, que foron capaces de desenvolver un protocolo de centrifugación de gradiente de densidade para illar o ADN das bacterias de E. coli xa que demostraron a replicación semi-conservadora do ADN durante o seu experimento de 1958.
Técnicas de extracción de ácido nucleico
Cales son as 4 etapas da extracción do ADN?
Todos os métodos de extracción reducen os mesmos pasos fundamentais.
Interrupción das células. Esta etapa, tamén coñecida como lise celular, consiste en romper a parede celular e/ou a membrana celular, para liberar os fluídos intra-celulares que conteñen os ácidos nucleicos de interese.
Eliminación de restos non desexados. Isto inclúe lípidos de membrana, proteínas e outros ácidos nucleicos non desexados que poden interferir nas aplicacións descendentes.
Illamento. Hai unha serie de xeitos diferentes de illar os ácidos nucleicos de interese do lisato despexado que creou, que entran entre dúas categorías principais: estado baseado en solucións ou sólido (ver sección seguinte).
Concentración. Despois de que os ácidos nucleicos foron illados de todos os demais contaminantes e diluentes, preséntanse nun eluado altamente concentrado.
Os dous tipos de extracción
Hai dous tipos de extracción de ácido nucleico: métodos baseados en solucións e métodos de estado sólido. O método baseado na solución tamén se coñece como método de extracción química, xa que implica usar produtos químicos para descompoñer a célula e acceder ao material nucleico. Isto pode usar compostos orgánicos como o fenol e o cloroformo, ou os compostos inorgánicos menos nocivos e polo tanto máis recomendados como a proteína K ou o xel de sílice.
Exemplos de diferentes métodos de extracción química para descompoñer unha cela inclúen:
- ruptura osmótica da membrana
- Dixestión enzimática da parede celular
- Solubilización da membrana
- con deterxentes
- con tratamento alcalino
As técnicas de estado sólido, tamén coñecidas como métodos mecánicos, implican explotar como o ADN interactúa cun substrato sólido. Ao seleccionar unha perla ou molécula á que se unirá o ADN, pero o analito non o fará, é posible separar os dous. Exemplos de técnicas de extracción en fase sólida, incluíndo usando sílice e perlas magnéticas.
Extracción de perlas magnéticas explicadas
O método de extracción de perlas magnéticas
O potencial de extracción con perlas magnéticas foi recoñecido por primeira vez nunha patente estadounidense presentada por Trevor Hawkins, para a Institución de Investigación do Instituto de Whitehead. Esta patente recoñeceu que era posible extraer material xenético uníndoos a un portador de apoio sólido, que podería ser unha perla magnética. O principio é que usa unha perla magnética altamente funcionalizada sobre a que se unirá o material xenético, que despois pode separarse do sobrenadante aplicando unha forza magnética ao exterior do buque sostendo a mostra.
Por que usar a extracción de perlas magnéticas?
A tecnoloxía de extracción de perlas magnéticas está cada vez máis prevalente, debido ao potencial que mantén para procedementos de extracción rápidos e eficientes. Nos últimos tempos houbo desenvolvementos de contas magnéticas altamente funcionalizadas con sistemas de tampón adecuados, que fixeron posible a automatización da extracción de ácido nucleico e un fluxo de traballo que é moi lixeiro e rendible. Ademais, os métodos de extracción de perlas magnéticas non implican os pasos de centrifugación que poden causar forzas de cizallamento que rompen anacos máis longos de ADN. Isto significa que as vertentes máis longas do ADN permanecen intactas, o que é importante nas probas de xenómica.
Tempo de publicación: novembro-25-2022