Introdución
Que é a extracción de ácidos nucleicos?
No máis simple dos termos, a extracción de ácidos nucleicos é a eliminación do ARN e/ou ADN dunha mostra e todo o exceso que non sexa necesario. O proceso de extracción illa os ácidos nucleicos dunha mostra e obtéñenos en forma de eluato concentrado, libre de diluyentes e contaminantes que poidan afectar a calquera aplicación posterior.
Aplicacións da extracción de ácidos nucleicos
Os ácidos nucleicos purificados utilízanse nunha infinidade de aplicacións diferentes, que van en múltiples industrias diferentes. A saúde é quizais a área onde máis se usa, con ARN e ADN purificados necesarios para unha serie de propósitos de proba diferentes.
As aplicacións da extracción de ácidos nucleicos na saúde inclúen:
- Amplificación por PCR e qPCR
- Secuenciación de próxima xeración (NGS)
- Xenotipado de SNP baseado na amplificación
- Xenotipado baseado en matrices
- Dixestión enzimática de restrición
- Análise mediante encimas modificadoras (por exemplo, ligación e clonación)
Tamén hai outros campos máis aló da saúde onde se utiliza a extracción de ácidos nucleicos, incluíndo, entre outros, as probas de paternidade, a medicina forense e a xenómica.
Breve historia da extracción de ácidos nucleicos
extracción de ADNdata de moito tempo atrás, sendo o primeiro illamento coñecido que realizou un médico suízo chamado Friedrich Miescher en 1869. Miescher esperaba resolver os principios fundamentais da vida determinando a composición química das células. Despois de fallar cos linfocitos, puido obter un precipitado bruto de ADN dos leucocitos atopados en pus en vendaxes descartadas. Fíxoo engadindo ácido e despois álcali á célula para deixar o citoplasma da célula, e despois desenvolveu un protocolo para separar o ADN das outras proteínas.
Tras a investigación innovadora de Miescher, moitos outros científicos avanzaron e desenvolveron técnicas para illar e purificar o ADN. Edwin Joseph Cohn, un científico de proteínas desenvolveu moitas técnicas para a purificación de proteínas durante a Segunda Guerra Mundial. Foi o responsable de illar a fracción de albúmina sérica do plasma sanguíneo, que é importante para manter a presión osmótica nos vasos sanguíneos. Isto foi crucial para manter os soldados vivos.
En 1953 Francis Crick, xunto con Rosalind Franklin e James Watson, determinaron a estrutura do ADN, demostrando que estaba formado por dúas cadeas de longas cadeas de nucleótidos de ácidos nucleicos. Este descubrimento revolucionario abriu o camiño para Meselson e Stahl, que foron capaces de desenvolver un protocolo de centrifugación por gradiente de densidade para illar o ADN das bacterias E. Coli mentres demostraron a replicación semi-conservadora do ADN durante o seu experimento de 1958.
Técnicas de extracción de ácidos nucleicos
Cales son as 4 etapas da extracción do ADN?
Todos os métodos de extracción redúcense aos mesmos pasos fundamentais.
Disrupción celular. Esta etapa, tamén coñecida como lise celular, consiste en romper a parede celular e/ou a membrana celular, para liberar os fluídos intracelulares que conteñen os ácidos nucleicos de interese.
Eliminación de residuos non desexados. Isto inclúe lípidos de membrana, proteínas e outros ácidos nucleicos non desexados que poden interferir coas aplicacións posteriores.
Illamento. Existen varias formas diferentes de illar os ácidos nucleicos de interese do lisado aclarado que creou, que se dividen en dúas categorías principais: en solución ou en estado sólido (consulte a seguinte sección).
Concentración. Despois de illar os ácidos nucleicos de todos os outros contaminantes e diluentes, preséntanse nun eluato moi concentrado.
Os dous tipos de extracción
Existen dous tipos de extracción de ácidos nucleicos: métodos baseados en solución e métodos de estado sólido. O método baseado en solucións tamén se coñece como método de extracción química, xa que implica o uso de produtos químicos para romper a célula e acceder ao material nucleico. Pode utilizarse ben compostos orgánicos como o fenol e o cloroformo, ou os compostos inorgánicos menos nocivos e, polo tanto, máis recomendados, como a Proteinase K ou o xel de sílice.
Exemplos de diferentes métodos de extracción química para romper unha célula inclúen:
- Rotura osmótica da membrana
- Dixestión enzimática da parede celular
- Solubilización de membrana
- Con deterxentes
- Con tratamento alcalino
As técnicas de estado sólido, tamén coñecidas como métodos mecánicos, consisten en explotar como o ADN interactúa cun substrato sólido. Seleccionando unha perla ou molécula á que se unirá o ADN pero non o fará o analito, é posible separar as dúas. Exemplos de técnicas de extracción en fase sólida, incluíndo o uso de sílice e perlas magnéticas.
Explicación da extracción de contas magnéticas
Método de extracción de perlas magnéticas
O potencial de extracción mediante contas magnéticas foi recoñecido por primeira vez nunha patente estadounidense presentada por Trevor Hawkins, para a institución de investigación do Instituto Whitehead. Esta patente recoñecía que era posible extraer material xenético uníndoo a un soporte sólido, que podería ser unha perla magnética. O principio é que se usa unha perla magnética altamente funcionalizada á que se unirá o material xenético, que despois pode separarse do sobrenadante aplicando unha forza magnética ao exterior do recipiente que contén a mostra.
Por que usar a extracción de contas magnéticas?
A tecnoloxía de extracción de contas magnéticas está a ser cada vez máis frecuente, debido ao potencial que posúe para procedementos de extracción rápidos e eficientes. Nos últimos tempos houbo desenvolvementos de esferas magnéticas altamente funcionalizadas con sistemas tampón axeitados, que posibilitaron a automatización da extracción de ácidos nucleicos e un fluxo de traballo moi lixeiro en recursos e económico. Ademais, os métodos de extracción de perlas magnéticas non implican os pasos de centrifugación que poden causar forzas de cizallamento que rompen anacos máis longos de ADN. Isto significa que as cadeas máis longas de ADN permanecen intactas, o que é importante nas probas de xenómica.
Hora de publicación: 25-novembro-2022