Como pipetear volumes pequenos con pipetas manuais

A medida que se está a centrar máis na redución de reactivos e custos, hai unha gran demanda de volumes máis pequenos, por exemplo, para a preparación de PCR Mastermix ou reaccións enzimáticas. Pero o pipeteo de pequenos volumes de 0,2 a 5 µL establece novos retos para a precisión e precisión do pipeteo. Os seguintes puntos son esenciais:

1. Tamaño da pipeta e da punta: elixe sempre a pipeta co volume nominal máis baixo posible e a punta máis pequena para manter a almofada de aire o máis pequena posible. Cando pipetee 1 µL, por exemplo, escolla unha pipeta de 0,25 – 2,5 µL e unha punta coincidente en lugar dunha pipeta de 1 – 10 µL.
2. Calibración e mantemento: é fundamental que as súas pipetas estean correctamente calibradas e mantidas. Os pequenos axustes e as pezas rotas nunha pipeta conducen a un aumento masivo dos valores de erro sistemáticos e aleatorios. Debe realizarse unha calibración segundo a norma ISO 8655 unha vez ao ano.
3. Pipetas de desprazamento positivo: comproba se tes unha pipeta de desprazamento positivo cun rango de volume baixo no teu laboratorio. En xeral, o uso deste tipo de pipetas conduce a un mellor resultado de pipeta en canto a exactitude e precisión que coas clásicas pipetas de colchón de aire.
4. Intente utilizar volumes maiores: pode considerar diluír a súa mostra para pipetear volumes maiores coa mesma cantidade na reacción final. Isto pode reducir os erros de pipeteo con volumes de mostra moi pequenos.

Ademais dunha boa ferramenta, o investigador debe ter unha moi boa técnica de pipeteo. Preste especial atención aos seguintes pasos:

1. Accesorio da punta: non coloque a pipeta na punta, xa que isto pode danar o extremo da punta fina e provocar que o feixe de líquido se desvíe ou dane o orificio. Só aplique unha lixeira presión ao conectar unha punta e use unha pipeta cun cono de punta con resorte.
2. Suxeitar a pipeta: Non manteña a pipeta na man mentres espera a centrífuga, o ciclador, etc. O interior da pipeta quentarase e levará a expansión da almofada de aire, producindo desviacións do volume establecido ao pipetear.
3. Prehumectación: a humidificación do aire no interior da punta e da pipeta prepara a punta para a mostra e evita a evaporación ao aspirar o volume de transferencia.
4. Aspiración vertical: é moi importante cando se manexan pequenos volumes para evitar o efecto capilar que se produce cando a pipeta se mantén en ángulo.
5. Profundidade de inmersión: mergulla a punta o menos posible para evitar que entre líquido na punta debido ao efecto capilar. Regra xeral: canto menor sexa a punta e o volume, menor será a profundidade de inmersión. Recoméndase un máximo de 2 mm ao pipetear volumes pequenos.
6. Distribución nun ángulo de 45°: o fluxo óptimo do líquido está garantido cando a pipeta se mantén nun ángulo de 45°.
7. Contacto coa parede do recipiente ou a superficie líquida: só se poden dispensar de forma adecuada os pequenos volumes cando a punta se suxeita contra a parede do recipiente ou se mergulla nun líquido. Incluso a última gota da punta pódese dispensar con precisión.
8. Blow-out: é obrigatorio un soplado despois de dispensar volumes baixos para dispensar ata a última gota de líquido presente na punta. A explosión tamén debe realizarse contra a parede do vaso. Teña coidado de non introducir burbullas de aire na mostra ao realizar unha explosión na superficie do líquido.