Aínda que en teoría, unha molécula do molde sería suficiente, normalmente úsanse cantidades considerablemente maiores de ADN para unha PCR clásica, por exemplo, ata 1 µg de ADN xenómico de mamíferos e tan pouco como 1 pg de ADN plasmídico. A cantidade óptima depende en gran medida do número de copias da secuencia de destino, así como da súa complexidade.
Se se utiliza moi pouca plantilla, será necesario un aumento correspondente no número de ciclos de amplificación para obter unha cantidade suficiente de produto. Unha polimerase Taq que se usa na maioría dos experimentos de PCR non presenta unha función de corrección (actividade exonuclease 3′-5′); así, os erros que se producen durante a amplificación non se poden corrixir. Canto maior sexa o número de ciclos, máis prevalente será a amplificación do produto defectuoso. Se, pola contra, a cantidade de molde é demasiado alta, aumentará a probabilidade de que os cebadores se asocien a outras secuencias (non cen por cen complementarias), así como a formación de dímeros de cebadores, o que dará lugar á amplificación de subprodutos. En moitos casos, o ADN está illado de cultivos celulares ou de microorganismos e posteriormente úsase como molde de PCR. Despois da purificación, é necesario determinar a concentración do ADN para poder definir o volume que é necesario para a configuración da PCR. Aínda que a electroforese en xel de agarosa pode servir para proporcionar unha estimación, este método dista moito de ser preciso. A espectrofotometría UV-Vis estableceuse como patrón de ouro para a cuantificación de ácidos nucleicos; este método directo e, polo tanto, fácil e rápido mide a absorbancia da mostra a 260 nm, e a concentración calcúlase coa axuda dun factor de conversión.
Non obstante, se a concentración de ADN é moi baixa (< 1 µg/mL dsDNA) ou se está contaminado con substancias que tamén absorben no intervalo de 260 nm (por exemplo, ARN, proteínas, sales), este método alcanzará as súas limitacións. No caso de concentracións moi baixas, as lecturas pronto serán demasiado imprecisas para ser útiles e as contaminacións levarán a unha sobreestimación (ás veces enorme) do valor real. Neste caso, a cuantificación mediante fluorescencia pode presentar unha alternativa. Esta técnica baséase no uso dun colorante fluorescente que se une especificamente ao dsDNA só o complexo que comprende ácido nucleico e colorante é excitado pola luz e, posteriormente, emitirá luz dunha lonxitude de onda lixeiramente superior. Aquí, a intensidade do sinal fluorescente é proporcional á cantidade de ADN, e para determinar a concentración avalíase en relación a unha curva estándar. As vantaxes deste método descansan na especificidade do enlace, que exclúe as influencias externas introducidas pola contaminación, así como na capacidade resultante para detectar concentracións moi baixas de ADN. A idoneidade de calquera dos métodos depende principalmente da concentración e pureza da mostra; en moitos casos incluso pode ser aconsellable aplicar ambos os métodos en paralelo.
Hora de publicación: 30-nov-2022