Cé go teoiriciúil, bheadh móilín amháin den teimpléad leordhóthanach, is iondúil go n -úsáidtear méideanna DNA i bhfad níos mó le haghaidh PCR clasaiceach, mar shampla, suas le 1 µg de DNA mamach géanómach agus chomh beag le 1 pg de DNA plasmid. Braitheann an méid is fearr ar líon na gcóipeanna den seicheamh sprice, chomh maith lena chastacht.
Mura n -úsáidtear an teimpléad beag, beidh gá le méadú comhfhreagrach ar líon na dtimthriallta aimplithe chun méid leordhóthanach táirge a fháil. Ní bhíonn feidhm cheartúcháin (gníomhaíocht exonuclease 3′-5 ′ i gceist le polaiméaráise taq a úsáidtear don chuid is mó de na turgnaimh PCR); Dá bhrí sin, ní féidir earráidí a tharlaíonn le linn aimplithe a cheartú. Dá airde an líon timthriallta, is ea is forleithne a bheidh aimpliú an táirge lochtach. Más rud é, ar an láimh eile, go bhfuil méid an teimpléid ró -ard, méadóidh an dóchúlacht go dtarlóidh primers le seichimh eile (ní céad faoin gcéad comhlántach), chomh maith le bunú dimers primer, a mbeidh méadú ar aimpliú na fotháirgí. In a lán cásanna, tá DNA scoite amach ó chultúir na gceall nó ó mhiocrorgánaigh agus ina dhiaidh sin úsáidtear é mar theimpléad PCR. Tar éis íonú, is gá tiúchan an DNA a chinneadh le bheith in ann an toirt atá ag teastáil don thus PCR a shainiú. Cé go bhféadfaidh leictreafóiréis ghlóthach agarose meastachán a sholáthar, níl an modh seo cruinn i bhfad. Bunaíodh Spectrophotometry UV-Vis mar an caighdeán óir chun aigéid núicléasacha a chainníochtú; Seo na bearta díreacha agus éasca agus tapa seo ionsúiteacht an tsampla ag 260 nm, agus ríomhtar an tiúchan le cabhair ó fhachtóir tiontaithe.
Má tá an tiúchan DNA an -íseal, áfach (<1 µg/ml dsDNA), nó má tá sé éillithe le substaintí a ionsúnn an raon 260 nm (m.sh. RNA, próitéin, salainn), sroichfidh an modh seo a theorainneacha. I gcás comhchruinnithe an -íseal, beidh na léamha ró -mhíchruinn go luath le húsáid, agus beidh ró -mheastachán (uaireanta ollmhór) ar an luach iarbhír mar thoradh ar éillithe. Sa chás seo, is féidir le cainníochtú ag baint úsáide as fluaraiseacht rogha eile a chur i láthair. Tá an teicníc seo bunaithe ar úsáid lí fluaraiseacha a cheanglaíonn go sonrach le dsDNA ach níl an coimpléasc a chuimsíonn aigéad núicléasach agus dath ar bís ag an solas, agus ina dhiaidh sin scaoilfidh sé solas tonnfhad beagán níos airde. Anseo, tá déine an chomhartha fhluaraisigh i gcomhréir le méid an DNA, agus chun an tiúchan a chinneadh déantar é a mheas maidir le cuar caighdeánach. Tá na buntáistí a bhaineann leis an modh seo ina luí ar shainiúlacht an bhanna, nach n -áirítear na tionchair sheachtracha a thugtar isteach trí éilliú, chomh maith leis an gcumas a leanann as comhchruinnithe an -íseal DNA a bhrath. Braitheann oiriúnacht ceachtar den dá mhodh go príomha ar chomhchruinniú samplach agus ar íonacht; In a lán cásanna, d'fhéadfadh sé a bheith inmholta an dá mhodh a chur i bhfeidhm go comhthreomhar.
Am Post: Samhain-30-2022