Cé gur leor go teoiriciúil móilín amháin den teimpléad, is gnách go n-úsáidtear méideanna i bhfad níos mó DNA le haghaidh PCR clasaiceach, mar shampla, suas le 1 µg de DNA mamaigh ghéanómach agus chomh beag le 1 lch de DNA plasmideach. Braitheann an méid is fearr is féidir go mór ar líon na gcóipeanna den seicheamh sprice, agus ar a chastacht.
Más fíorbheagán teimpléad a úsáidtear, beidh gá le méadú comhfhreagrach ar líon na dtimthriallta aimpliúcháin chun méid leordhóthanach táirge a fháil. Níl feidhm cheartúcháin ag polaiméaráis Taq a úsáidtear don chuid is mó de thurgnaimh PCR (gníomhaíocht exonuclease 3′-5′); mar sin, ní féidir earráidí a tharlaíonn le linn aimpliúcháin a cheartú. Dá airde líon na dtimthriallta, is amhlaidh is forleithne a bheidh an t-aimpliú ar an táirge lochtach. Más rud é, ar an láimh eile, go bhfuil an méid teimpléid ró-ard, méadóidh an dóchúlacht go n-aistreoidh primers go sraitheanna eile (ní céad faoin gcéad moltach), chomh maith le bunú dimers primer, rud a fhágann go dtiocfaidh aimpliú ar. seachtháirgí. I go leor cásanna, tá DNA scoite amach ó chultúir cille nó ó mhiocrorgánaigh agus ina dhiaidh sin úsáidtear é mar theimpléad PCR. Tar éis íonú, is gá tiúchan an DNA a chinneadh chun a bheith in ann an toirt a theastaíonn don socrú PCR a shainiú. Cé go bhféadfadh leictreafóiréis glóthach agarose meastachán a sholáthar, níl an modh seo i bhfad ó bheith cruinn. Tá speictrophotiméadracht UV-Vis bunaithe mar chaighdeán óir chun aigéid núicléacha a chainníochtú; tomhaiseann an modh díreach agus dá bhrí sin éasca agus tapa ionsú an tsampla ag 260 nm, agus déantar an tiúchan a ríomh le cabhair ó fhachtóir coinbhéartachta.
Má tá an tiúchan DNA an-íseal, áfach (< 1 µg/mL dsDNA), nó má tá sé éillithe le substaintí a ionsúnn sa raon 260 nm freisin (m.sh. RNA, próitéin, salainn), bainfidh an modh seo a theorainneacha amach. I gcás comhchruinnithe an-íseal, ní fada go n-éireoidh na léamha ró-mhíchruinn le húsáid, agus beidh ró-mheastachán (uaireanta ollmhór) ar an luach iarbhír mar thoradh ar éilliúcháin. Sa chás seo, d’fhéadfadh go mbeadh rogha eile le sonrú trí fhluaraiseacht a úsáid. Tá an teicníocht seo bunaithe ar úsáid a bhaint as ruaim fluaraiseacha a cheanglaíonn go sonrach le dsDNA ach an coimpléasc a chuimsíonn aigéad núicléach agus ruaim a sceith an solas, agus ina dhiaidh sin astóidh sé solas le tonnfhad beagán níos airde. Anseo, tá déine an chomhartha fluaraiseacha comhréireach leis an méid DNA, agus chun an tiúchan a chinneadh déantar é a mheas maidir le cuar caighdeánach. Luíonn buntáistí an mhodha seo ar shainiúlacht an bhanna, rud a fhágann na tionchair sheachtracha a thugann éilliú isteach, chomh maith leis an gcumas mar thoradh air tiúchain an-íseal DNA a bhrath. Braitheann oiriúnacht ceachtar den dá mhodh go príomha ar thiúchan agus íonacht an tsampla; i go leor cásanna b'fhéidir go mbeadh sé inmholta an dá mhodh a chur i bhfeidhm go comhthreomhar.
Am postála: Nov-30-2022