Foar suksesfolle amplifikaasje-reaksjes is it nedich dat de komponinten foar yndividuele reaksje oanwêzich binne yn 'e juste konsintraasje yn elke tarieding. Derneist is it wichtich dat gjin besmetting foarkomt.
Benammen as in protte reaksjes moatte wurde ynsteld, is it fêststeld om in saneamde Master Mix te tarieden yn plak fan elke reagens apart yn elke skip te pipjen. Pre-konfigureare miks binne kommersjeel te krijen, wêryn allinich foarbyldspesifike komponinten (primer) en wetter wurde tafoege. As alternatyf kin de Master Mix troch josels taret wurde. Yn beide farianten wurdt it mingsel ferspraat oan elke PCR-skip sûnder in sjabloan en it yndividuele DNA-sample wurdt apart tafoege oan it ein.
It brûken fan in Master Mix hat ferskate foardielen: earst, it oantal fan ien pipettingstappen wurdt fermindere. Op dizze manier binne sawol it risiko fan brûkerfouten by pipetting en it risiko fan fersmoarging is minimalisearre en is fansels tiid besparre. Yn prinsipe is de pipetting krektens ek heger, om't grutterevolumes binne dosearre. Dit is maklik te begripen by it kontrolearjen fan 'e technyske gegevens fan Pipettes: de lytsere it dosearre folume, hoe heger de ôfwikingen kinne wêze. It feit dat alle tariedingen komme út itselde skip hat in posityf effekt op homogeniteit (as goed mingd). Dit ferbetteret ek de reprodusearberens fan 'e eksperiminten.
By it tarieden fan 'e Master Mix, moat op syn minst 10% ekstra folume wurde tafoege (bygelyks 10 tariedingen binne ferplicht, berekkenje op basis fan 11), sadat jo sels it lêste skip goed ynfold. Op dizze manier, (lichte) pipetearje unakkuracies, en it effekt fan stambl ferlies by it dosearjen fan wasmiddel - befette oplossingen kinne wurde kompensearre. Detergenten wurde befette yn enzymolutions lykas polymanten en master mingt, wêrtroch Foam-formaasje en resten op it binnenste oerflak fan normaal binnePipette tips.
Ofhinklik fan 'e applikaasje en it type floeistof te útjûn wurde, de juste pipettingtechnyk (1) moat wurde keazen en de geskikte apparatuer selektearre. Foar oplossingen mei detergenten, in direkte ferpleatsingssysteem of de saneamde "Lege retinsje" Pipette-tips as alternatyf foar loftkush-pipettes wurde oanrikkemandearre. It effekt fanAce Pipette Tipis basearre op in bysûnder hydrophobyske oerflak. Vloeistoffen dy't wasmiddelen befetsje, lit gjin resesu-film efterlitte oan 'e binnenkant en bûten, sadat it ferlies fan oplossing kin wurde minimeare.
Neist it krekte dosearjen fan alle komponinten is it ek wichtich dat gjin besmetting fan 'e tariedings foarkomt. It is net genôch om konsuminten fan hege suverens te brûken, om't it pipettingsproses yn in loftkuskolkolette aerosols kin produsearje dy't yn 'e pipette bliuwe. De DNA dy't kin wurde befette yn it Aerosol kin wurde oerdroegen fan it iene stekproef nei it folgjende yn 'e folgjende pipettingestap en dus liede ta kontaminaasje. De hjirboppe neamde direkte Defacement-systemen neamd kin dit risiko ek minimalisearje. Foar loftkusjige pipetes makket it sin om filtertips te brûken om de pipette-kegel te beskermjen troch spatten, aerosolen en biomolekulen te beskermjen.
Posttiid: DEC-06-2022