Ynlieding
Wat is Nucleic Acid Extraction?
Yn 'e heul ienfâldichste termen is nukleïnsoerwinning it fuortheljen fan it RNA en / of DNA fan in stekproef en al it oerskot dat net nedich is. It proses fan ekstraksje isolearret de nukleïnesoeren út in stekproef en jout se yn 'e foarm fan in konsintrearre eluaat, frij fan diluents en kontaminanten dy't alle streamôfwerts tapassingen kinne beynfloedzje.
Tapassingen fan Nucleic Acid Extraction
Purified nucleic soeren wurde brûkt yn in oerfloed fan ferskillende tapassingen, fariearjend oer meardere ferskillende yndustry. Sûnenssoarch is miskien it gebiet wêr't it it meast wurdt brûkt, mei suvere RNA en DNA nedich foar in gasthear fan ferskate testdoelen.
Tapassingen fan ekstraksje fan nukleïnesûr yn sûnenssoarch omfetsje:
- Next Generation Sequencing (NGS)
- Amplification-basearre SNP Genotyping
- Array-basearre genotyping
- Restriksje Enzyme Digestion
- Analyses mei feroarjende enzymen (bygelyks ligaasje en klonen)
D'r binne ek oare fjilden bûten sûnenssoarch wêr't nukleïnesûrwinning wurdt brûkt, ynklusyf mar net beheind ta paternity testing, forensics en genomics.
In koarte skiednis fan Nucleic Acid Extraction
DNA-ekstraksjedatearret in lange wei, mei't de earste bekende isolaasje waard útfierd troch in Switserske dokter mei de namme Friedrich Miescher yn 1869. Miescher hope de fûnemintele prinsipes fan it libben op te lossen troch de gemyske gearstalling fan sellen te bepalen. Nei't er mislearre mei lymfozyten, koe er in rûch delslach fan DNA krije fan leukozyten fûn yn pus op ôfset ferbannen. Hy die dit troch it tafoegjen fan soer en dan alkali oan 'e sel om it cytoplasma fan' e sel te ferlitten, en ûntwikkele doe in protokol om it DNA te skieden fan 'e oare aaiwiten.
Nei it baanbrekkend ûndersyk fan Miescher, binne in protte oare wittenskippers trochgean en techniken te ûntwikkeljen om DNA te isolearjen en te suverjen. Edwin Joseph Cohn, in proteïnwittenskipper ûntwikkele in protte techniken foar proteïnereiniging tidens WW2. Hy wie ferantwurdlik foar it isolearjen fan de serumalbuminefraksje fan bloedplasma, wat wichtich is foar it behâld fan de osmotyske druk yn 'e bloedfetten. Dit wie krúsjaal om soldaten yn libben te hâlden.
Yn 1953 bepale Francis Crick, tegearre mei Rosalind Franklin en James Watson, de struktuer fan DNA, wêrby't bliken die dat it wie opboud út twa stringen fan lange keatlingen fan nukleïnesoere nukleotiden. Dizze trochbraak ûntdekking makke it paad foar Meselson en Stahl, dy't in tichtheidsgradient-sintrifugeringsprotokol ûntwikkelje koenen om DNA te isolearjen fan E. Coli-baktearjes, om't se de semy-konservative replikaasje fan DNA demonstreare tidens har eksperimint fan 1958.
Techniken fan Nucleic Acid Extraction
Wat binne de 4 stadia fan DNA-ekstraksje?
Alle ekstraksjemetoaden siede op deselde fûnemintele stappen.
Cell Disruption. Dit poadium, ek wol sellysis neamd, omfettet it ôfbrekken fan 'e selmuorre en / of it selmembraan, om de intra-sellulêre fluids frij te litten dy't de nukleïnesoeren fan belang befetsje.
Fuortsmite fan net winske pún. Dit omfettet membraanlipiden, aaiwiten en oare net winske nukleïnesoeren dy't kinne ynterferearje mei streamôfwerts tapassingen.
Isolaasje. D'r binne in oantal ferskillende manieren om de nukleïnesoeren fan belang te isolearjen fan 'e ferwidere lysate dy't jo makke hawwe, dy't falle tusken twa haadkategoryen: oplossing basearre of fêste steat (sjoch folgjende paragraaf).
Konsintraasje. Neidat de nucleic soeren binne isolearre út alle oare kontaminanten en diluents, se wurde presintearre yn in heech-konsintrearre eluaat.
De twa soarten ekstraksje
D'r binne twa soarten nukleïnsûrekstraksje - oplossingsbasearre metoaden en metoaden foar fêste steat. De oplossing basearre metoade is ek bekend as de gemyske ekstraksjemetoade, om't it giet om it brûken fan gemikaliën om de sel ôf te brekken en tagong te krijen ta it nukleïnemateriaal. Dit kin wêze mei it brûken fan organyske ferbiningen lykas fenol en chloroform, of de minder skealike en dêrom mear oan te rieden anorganyske ferbiningen lykas Proteinase K of silikagel.
Foarbylden fan ferskate gemyske ekstraksjemetoaden om in sel ôf te brekken binne:
- Osmotic rupturing fan membraan
- Enzymatyske digestion fan selwand
- Solubilization fan membraan
- Mei wasmiddelen
- Mei alkali behanneling
Solid state techniken, ek wol meganyske metoaden neamd, omfetsje it brûken fan hoe't DNA ynteraksje mei in fêst substraat. Troch in kraal of molekule te selektearjen dêr't it DNA oan bine sil, mar de analyt net, is it mooglik om de twa te skieden. Foarbylden fan techniken foar fêste-fase ekstraksje ynklusyf it brûken fan silika en magnetyske kralen.
Magnetic Bead Extraction útlein
De metoade foar ekstraksje fan magnetyske kralen
It potinsjeel foar ekstraksje mei magnetyske kralen waard earst erkend yn in Amerikaanske oktroai yntsjinne troch Trevor Hawkins, foar de Whitehead Institute ûndersyksynstitút. Dit oktroai erkende dat it mooglik wie om genetysk materiaal te ekstrahearjen troch se te binen oan in fêste stipedrager, dy't in magnetyske kraal wêze koe. It prinsipe is dat jo in tige funksjonalisearre magnetyske kraal brûke wêrop it genetysk materiaal sil bine, dat dan kin wurde skieden fan 'e supernatant troch in magnetyske krêft oan te passen oan' e bûtenkant fan it skip dat it monster hâldt.
Wêrom brûke magnetyske kralenekstraksje?
Magnetyske bead-ekstraksjetechnology wurdt hieltyd mear foarkommen, fanwegen it potensjeel dat it hat foar rappe en effisjinte ekstraksjeprosedueres. Yn resinte tiden binne d'r ûntjouwings west fan tige funksjonalisearre magnetyske kralen mei passende buffersystemen, dy't automatisearring fan nukleïnsûrwinning mooglik makke hawwe en in workflow dy't heul boarne ljocht en kosten-effisjint is. Ek belûke metoaden foar ekstraksje fan magnetyske kralen net de sintrifugaasjestappen dy't skeakrêften kinne feroarsaakje dy't langere stikken DNA opbrekke. Dit betsjut dat langere DNA-strengen yntakt bliuwe, wat wichtich is yn genomyske testen.
Post tiid: Nov-25-2022