Pour réussir les réactions d’amplification, il est nécessaire que les différents composants de la réaction soient présents à la concentration correcte dans chaque préparation. De plus, il est important qu’aucune contamination ne se produise.
En particulier lorsque de nombreuses réactions doivent être préparées, il a été établi de préparer ce que l'on appelle un mélange maître au lieu de pipeter chaque réactif séparément dans chaque récipient. Des mélanges préconfigurés sont disponibles dans le commerce, dans lesquels seuls des composants spécifiques à l'échantillon (apprêt) et de l'eau sont ajoutés. Alternativement, le master mix peut être préparé par vous-même. Dans les deux variantes, le mélange est distribué dans chaque récipient PCR sans matrice et l'échantillon d'ADN individuel est ajouté séparément à la fin.
L'utilisation d'un master mix présente plusieurs avantages : Premièrement, le nombre d'étapes de pipetage uniques est réduit. De cette manière, le risque d'erreurs de l'utilisateur lors du pipetage et le risque de contamination sont minimisés et, bien sûr, un gain de temps est réalisé. En principe, la précision du pipetage est également plus élevée, car des volumes plus importants sont dosés. Ceci est facile à comprendre lorsqu'on vérifie les caractéristiques techniques des pipettes : plus le volume dosé est petit, plus les écarts peuvent être importants . Le fait que toutes les préparations proviennent du même récipient a un effet positif sur l'homogénéité (si bien mélangé). Cela améliore également la reproductibilité des expériences.
Lors de la préparation du master mix, il convient d'ajouter au moins 10 % de volume supplémentaire (par exemple, si 10 préparations sont nécessaires, calculer sur la base de 11), afin que même le dernier récipient soit correctement rempli. De cette manière, les (légères) imprécisions de pipetage et l'effet de la perte d'échantillon lors du dosage de solutions contenant des détergents peuvent être compensés. Les détergents sont contenus dans des solutions enzymatiques telles que les polymérases et les mélanges maîtres, provoquant la formation de mousse et la formation de résidus sur la surface interne des matières normales.pointes de pipettes.
En fonction de l'application et du type de liquide à distribuer, la bonne technique de pipetage (1) doit être choisie et l'équipement approprié sélectionné. Pour les solutions contenant des détergents, un système à déplacement direct ou des embouts de pipettes dits « à faible rétention » comme alternative aux pipettes à coussin d'air sont recommandés. L'effet deEmbout PIPETTE ACErepose sur une surface particulièrement hydrophobe. Les liquides contenant des détergents ne laissent pas de film résiduel à l'intérieur et à l'extérieur, ce qui permet de minimiser la perte de solution.
Outre le dosage exact de tous les composants, il est également important qu'aucune contamination des préparations ne se produise. Il ne suffit pas d'utiliser des consommables de haute pureté, car le processus de pipetage dans une pipette à coussin d'air peut produire des aérosols qui restent dans la pipette. L'ADN éventuellement contenu dans l'aérosol peut être transféré d'un échantillon à l'autre lors de l'étape de pipetage suivante et ainsi conduire à une contamination. Les systèmes à déplacement direct mentionnés ci-dessus peuvent également minimiser ce risque. Pour les pipettes à coussin d'air, il est judicieux d'utiliser des pointes à filtre pour protéger le cône de la pipette en retenant les éclaboussures, les aérosols et les biomolécules.
Heure de publication : 06 décembre 2022