Pour les réactions d'amplification réussies, il est nécessaire que les composants de réaction individuels soient présents dans la concentration correcte dans chaque préparation. De plus, il est important qu'aucune contamination ne se produise.
Surtout lorsque de nombreuses réactions doivent être configurées, elle a été établie pour préparer un mélange dit maître au lieu de pipeter chaque réactif séparément dans chaque navire. Des mélanges préconfigurés sont disponibles dans le commerce, dans lesquels seuls les composants spécifiques à l'échantillon (amorce) et l'eau sont ajoutés. Alternativement, le mélange maître peut être préparé par vous-même. Dans les deux variantes, le mélange est distribué à chaque vaisseau PCR sans modèle et l'échantillon d'ADN individuel est ajouté séparément à la fin.
L'utilisation d'un mélange maître présente plusieurs avantages: premièrement, le nombre d'étapes de pipetage unique est réduit. De cette façon, à la fois le risque d'erreurs de l'utilisateur pendant le pipetage et le risque de contamination sont minimisés et, bien sûr, du temps est économisé. En principe, la précision de pipetage est également plus élevée, car des volumes plus importants sont dosés. Ceci est facile à comprendre lors de la vérification des données techniques des pipettes: plus le volume dosé est petit, plus les écarts peuvent être élevés. Le fait que toutes les préparations proviennent du même navire a un effet positif sur l'homogénéité (s'il est bien mélangé). Cela améliore également la reproductibilité des expériences.
Lors de la préparation du mélange maître, au moins 10% de volume supplémentaire doivent être ajoutés (par exemple si 10 préparations sont nécessaires, calculez sur la base de 11), de sorte que même le dernier navire se remplit correctement. De cette façon, (légers) des inexactitudes de pipetage, et l'effet de la perte d'échantillon lorsque les solutions contenant des détergents peuvent être compensées. Les détergents sont contenus dans des solutions enzymatiques telles que les polymérases et les mélanges maîtres, provoquant la formation de mousse et les résidus sur la surface intérieure de la normaleConseils de pipette.
Selon l'application et le type de liquide à distribuer, la bonne technique de pipetage (1) doit être choisie et l'équipement approprié sélectionné. Pour les solutions contenant des détergents, un système de déplacement direct ou les conseils dits de pipette de «faible rétention» comme alternative pour les pipettes de coussin d'air sont recommandés. L'effetConseil de pipette ACEest basé sur une surface particulièrement hydrophobe. Les liquides contenant des détergents ne laissent pas de film de résidu à l'intérieur et à l'extérieur, afin que la perte de solution puisse être minimisée.
Outre le dosage exact de tous les composants, il est également important qu'aucune contamination des préparations ne se produise. Il n'est pas suffisant d'utiliser des consommables de haute pureté, car le processus de pipetage dans une pipette de coussin d'air peut produire des aérosols qui restent dans la pipette. L'ADN qui peut être contenu dans l'aérosol peut être transféré d'un échantillon à la suivante dans l'étape de pipetage suivant et ainsi entraîner une contamination. Les systèmes de déplacement direct mentionnés ci-dessus peuvent également minimiser ce risque. Pour les pipettes de coussin d'air, il est logique d'utiliser des pointes de filtre pour protéger le cône de pipette en conservant les éclaboussures, les aérosols et les biomolécules.
Temps de poste: DEC-06-2022