Flacons cryogéniquessont couramment utilisés pour le stockage cryogénique de lignées cellulaires et d’autres matériels biologiques critiques, dans des dewars remplis d’azote liquide.

La préservation réussie des cellules dans l’azote liquide comporte plusieurs étapes. Bien que le principe de base soit une congélation lente, la technique exacte utilisée dépend du type de cellule et du cryoprotecteur utilisé. Il existe plusieurs considérations de sécurité et bonnes pratiques à prendre en compte lors du stockage de cellules à des températures aussi basses.

Cet article vise à donner un aperçu de la façon dont les cryotubes sont stockés dans l’azote liquide.

Que sont les cryovials

Les cryovials sont de petits flacons bouchés conçus pour conserver des échantillons liquides à des températures extrêmement basses. Ils garantissent que les cellules conservées dans le cryoprotecteur n'entrent pas en contact direct avec l'azote liquide, minimisant ainsi le risque de fractures cellulaires tout en bénéficiant de l'effet refroidissant extrême de l'azote liquide.

Les flacons sont généralement disponibles dans une gamme de volumes et de modèles : ils peuvent être filetés intérieurement ou extérieurement avec des fonds plats ou arrondis. Des formats stériles et non stériles sont également disponibles.

Qui utiliseCyroviauxstocker les cellules dans l’azote liquide

Une gamme de laboratoires du NHS et privés, ainsi que des instituts de recherche spécialisés dans les banques de sang de cordon, la biologie des cellules épithéliales, l'immunologie et la biologie des cellules souches, utilisent des cryotubes pour cryoconserver les cellules.

Les cellules ainsi préservées comprennent les cellules B et T, les cellules CHO, les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques, les hybridomes, les cellules intestinales, les macrophages, les cellules souches et progénitrices mésenchymateuses, les monocytes, le myélome, les cellules NK et les cellules souches pluripotentes.

Présentation de la conservation des flacons cryogéniques dans l'azote liquide

La cryoconservation est un processus qui préserve les cellules et autres constructions biologiques en les refroidissant à des températures très basses. Les cellules peuvent être stockées dans l’azote liquide pendant des années sans perte de viabilité cellulaire. Ceci est un aperçu des procédures employées.

Préparation cellulaire

La méthode exacte de préparation des échantillons varie en fonction du type de cellule, mais en général, les cellules sont collectées et centrifugées pour développer un culot riche en cellules. Ce culot est ensuite remis en suspension dans le surnageant mélangé à un cryoprotecteur ou un milieu de cryoconservation.

Milieu de cryoconservation

Ce milieu est utilisé pour préserver les cellules dans les environnements à basse température auxquels elles seront soumises en inhibant la formation de cristaux intra et extracellulaires et donc la mort cellulaire. Leur rôle est de fournir un environnement sûr et protecteur aux cellules et aux tissus pendant les processus de congélation, de stockage et de décongélation.

Un milieu tel que du plasma frais congelé (FFP), une solution de plasmalyte hépariné ou des solutions sans sérum et sans composants animaux est mélangé à des cryoprotecteurs tels que le diméthylsulfoxyde (DMSO) ou le glycérol.

Le culot d'échantillon re-liquéfié est aliquoté dans des flacons cryogéniques en polypropylène tels queFioles de stockage cryogénique de la société biomédicale Suzhou Ace.

Il est important de ne pas trop remplir les cryotubes car cela augmenterait le risque de fissuration et la possible libération du contenu (1).

Taux de gel contrôlé

En général, une vitesse de congélation lente et contrôlée est utilisée pour réussir la cryoconservation des cellules.

Une fois les échantillons aliquotés dans des flacons cryogéniques, ils sont placés sur de la glace humide ou dans un réfrigérateur à 4 ℃ et la procédure de congélation démarre dans les 5 minutes. En règle générale, les cellules sont refroidies à une vitesse de -1 à -3 par minute (2). Ceci est réalisé à l'aide d'un refroidisseur programmable ou en plaçant les flacons dans une boîte isotherme placée dans un congélateur à vitesse contrôlée de –70 °C à –90 °C.

Transfert vers l'azote liquide

Les flacons cryogéniques congelés sont ensuite transférés dans un réservoir d'azote liquide pour des périodes indéfinies à condition de maintenir une température inférieure à -135℃.

Ces températures ultra-basses peuvent être obtenues par immersion dans l'azote en phase liquide ou vapeur.

Phase liquide ou vapeur ?

Le stockage dans l’azote en phase liquide est connu pour maintenir la température froide avec une cohérence absolue, mais il n’est souvent pas recommandé pour les raisons suivantes :

• Le besoin de grands volumes (profondeur) d'azote liquide qui constitue un danger potentiel. Les brûlures ou l'asphyxie qui en résultent constituent un risque réel.
• Cas documentés de contamination croisée par des agents infectieux tels que l'aspergillus, l'hépatite B et la propagation virale via le milieu azote liquide (2,3)
• Possibilité de fuite d'azote liquide dans les flacons pendant l'immersion. Lorsqu’il est retiré du stockage et réchauffé à température ambiante, l’azote se dilate rapidement. Par conséquent, le flacon peut se briser lorsqu'il est retiré du stockage d'azote liquide, créant un risque à la fois de débris volants et d'exposition au contenu (1, 4).

Pour ces raisons, le stockage à très basse température se fait le plus souvent dans l’azote en phase vapeur. Lorsque les échantillons doivent être stockés en phase liquide, des tubes cryoflex spécialisés doivent être utilisés.

L’inconvénient de la phase vapeur est qu’un gradient de température vertical peut se produire, entraînant des fluctuations de température entre -135℃ et -190℃. Cela nécessite une surveillance minutieuse et diligente des niveaux d’azote liquide et des variations de température (5).

De nombreux fabricants recommandent que les cryotubes soient adaptés au stockage jusqu'à -135 ℃ ou à une utilisation en phase vapeur uniquement.

Décongeler vos cellules cryoconservées

La procédure de décongélation est stressante pour une culture congelée, et une manipulation et une technique appropriées sont nécessaires pour garantir une viabilité, une récupération et une fonctionnalité optimales des cellules. Les protocoles de décongélation exacts dépendront des types de cellules spécifiques. Cependant, une décongélation rapide est considérée comme standard pour :

• Diminuer tout impact sur la récupération cellulaire
• Aide à réduire le temps d'exposition aux solutés présents dans les milieux de congélation
• Minimiser les dommages dus à la recristallisation de la glace

Des bains-marie, des bains de billes ou des instruments automatisés spécialisés sont couramment utilisés pour décongeler les échantillons.

Le plus souvent, une lignée cellulaire est décongelée à la fois pendant 1 à 2 minutes, en la faisant tourner doucement dans un bain-marie à 37 ℃ jusqu'à ce qu'il ne reste qu'un petit peu de glace dans le flacon avant de la laver dans un milieu de croissance préchauffé.

Pour certaines cellules comme les embryons de mammifères, un réchauffement lent est essentiel à leur survie.

Les cellules sont désormais prêtes pour la culture cellulaire, l’isolement cellulaire ou, dans le cas des cellules souches hématopoïétiques, des études de viabilité pour garantir l’intégrité des cellules souches du donneur avant le traitement myéloablatif.

Il est normal de prélever de petites aliquotes de l’échantillon prélavé utilisé pour effectuer une numération cellulaire afin de déterminer les concentrations cellulaires pour l’étalement en culture. Vous pouvez ensuite évaluer les résultats des procédures d’isolement cellulaire et déterminer la viabilité cellulaire.

Meilleures pratiques pour le stockage des cryotubes

Le succès de la cryoconservation des échantillons stockés dans des flacons cryogéniques dépend de nombreux éléments du protocole, notamment un stockage et une tenue de registres appropriés.

• Diviser les cellules entre les emplacements de stockage– Si les volumes le permettent, divisez les cellules entre les flacons et stockez-les dans des emplacements séparés pour réduire le risque de perte d'échantillon due à des pannes d'équipement.
• Prévenir la contamination croisée– Opter pour des flacons cryogéniques stériles à usage unique ou en autoclave avant une utilisation ultérieure
• Utilisez des flacons de taille appropriée pour vos cellules– les flacons sont disponibles dans une gamme de volumes compris entre 1 et 5 ml. Évitez de trop remplir les flacons pour réduire le risque de fissuration.
• Sélectionnez des flacons cryogéniques à filetage interne ou externe– Les flacons à filetage interne sont recommandés par certaines universités pour des raisons de sécurité – ils peuvent également empêcher la contamination lors du remplissage ou lorsqu'ils sont stockés dans l'azote liquide.
• Prévenir les fuites- Utiliser des joints bi-injectés moulés dans le bouchon à vis ou les joints toriques pour éviter les fuites et la contamination.
• Utilisez des codes-barres 2D et des flacons d'étiquettes– pour assurer la traçabilité, des flacons dotés de grandes zones d'écriture permettent d'étiqueter adéquatement chaque flacon. Les codes-barres 2D peuvent faciliter la gestion du stockage et la tenue des registres. Les capuchons à code couleur sont utiles pour une identification plus facile.
• Entretien adéquat du stockage- Pour garantir que les cellules ne soient pas perdues, les récipients de stockage doivent surveiller en permanence la température et les niveaux d'azote liquide. Des alarmes doivent être installées pour alerter les utilisateurs des erreurs.

Précautions de sécurité

L'azote liquide est devenu une pratique courante dans la recherche moderne, mais comporte un risque de blessures graves s'il est utilisé incorrectement.

Un équipement de protection individuelle (EPI) approprié doit être porté pour minimiser le risque d'engelures, de brûlures et d'autres incidents indésirables lors de la manipulation de l'azote liquide. Porter

• Gants cryogéniques
• Blouse de laboratoire
• Écran facial complet résistant aux chocs qui couvre également le cou
• Chaussures fermées
• Tablier en plastique résistant aux éclaboussures

Les réfrigérateurs à azote liquide doivent être placés dans des zones bien ventilées pour minimiser le risque d'asphyxie – l'azote qui s'échappe se vaporise et déplace l'oxygène atmosphérique. Les magasins à grand volume devraient être équipés de systèmes d’alarme en cas de faible niveau d’oxygène.

Le travail en binôme lors de la manipulation de l’azote liquide est idéal et son utilisation en dehors des heures normales de travail doit être interdite.

Des flacons cryogéniques pour prendre en charge votre flux de travail

La société Suzhou Ace Biomedical propose une large sélection de produits qui répondent à vos besoins en cryoconservation pour différents types de cellules. La gamme comprend une gamme de tubes ainsi qu'une gamme de flacons cryogéniques stériles.

Nos cryotubes sont :

• Bouchon à vis de laboratoire 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml Cryovial Flacons cryogéniques Cryotube à fond conique avec joint

  ● Spécifications de 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, avec jupe ou sans jupe
  ● Une conception conique ou autonome, stérile ou non stérile est disponible
  ● Les tubes à bouchon à vis sont en polypropylène de qualité médicale
  ● Les flacons de cryotubes PP peuvent être congelés et décongelés à plusieurs reprises.
  ●La conception du capuchon externe peut réduire la probabilité de contamination pendant le traitement des échantillons.
  ● Tubes cryogéniques à bouchon à vis Filetages de vis universels pour utilisation
  ● Les tubes s'adaptent à la plupart des rotors courants
  ● Les tubes à joint torique des tubes cryogéniques conviennent aux boîtes de congélation standard de 1 pouce et 2 pouces, 48 ​​puits, 81 puits, 96 puits et 100 puits.
  ● Autoclavable à 121°C et congelable à -86°C

  N° DE PIÈCE	MATÉRIEL	VOLUME	CAPUCHONCOULEUR	Pièces/SAC	SACS/ÉTUI
  ACT05-BL-N	PP	0,5ML	Noir, jaune, bleu, rouge, violet, blanc	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5ML	Noir, jaune, bleu, rouge, violet, blanc	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5ML	Noir, jaune, bleu, rouge, violet, blanc	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0ML	Noir, jaune, bleu, rouge, violet, blanc	500	10