La normalisation des processus comprend leur optimisation et leur établissement et l'harmonisation ultérieures, permettant des performances optimales à long terme - indépendantes de l'utilisateur. La normalisation garantit des résultats de haute qualité, ainsi que leur reproductibilité et leur comparabilité.
L'objectif de la PCR (classique) est la génération d'un résultat fiable et reproductible. Pour certaines applications, le rendement duProduit PCRest également pertinent. Pour ces réactions, il faut veiller à ce que les échantillons ne soient pas compromis et que le flux de travail de la PCR reste stable. Plus précisément, cela se traduit par la minimisation de l'introduction de contaminations qui pourraient conduire à des résultats faux positifs ou faux négatifs ou même inhiber la réaction de PCR. De plus, les conditions de réaction doivent être aussi identiques que possible pour chaque échantillon individuel dans un exécution et également être transférable à des réactions ultérieures (de la même méthode). Cela fait référence à la composition des réactions ainsi qu'au type de contrôle de la température dans le cycler. Les erreurs de l'utilisateur, bien sûr, doivent être évitées autant que possible.
Ci-dessous, nous allons démontrer les défis qui sont rencontrés lors de la préparation et tout au long de la PCR - et les approches des solutions qui existent en ce qui concerne les instruments et les consommables utilisés pour la normalisation des flux de travail PCR.
Préparation de réaction
La distribution des composants de réaction dans les vaisseaux PCR ou les plaques, respectivement, comprend de multiples défis qui doivent être surmontés:
Conditions de réaction
Le dosage exact et précis des composants individuels est indispensable pour viser les conditions de réaction les plus identiques possibles. En plus d'une bonne technique de pipetage, la sélection du bon outil est essentielle. Les maîtres de PCR contiennent fréquemment des substances qui augmentent la viscosité ou génèrent de la mousse. Pendant le processus de pipetage, ceux-ci conduisent à un mouillage substantielConseils de pipette, réduisant ainsi la précision de pipetage. L'utilisation de systèmes de distribution directe ou de pointes de pipette alternatives qui sont moins sujettes au mouillage peut améliorer la précision et la précision du processus de pipetage.
Contaminations
Pendant le processus de distribution, des aérosols sont générés qui, s'ils sont autorisés à atteindre l'intérieur de la pipette, peuvent potentiellement contaminer un autre échantillon pendant la prochaine étape de pipetage. Cela peut être évité en utilisant des pointes de filtre ou des systèmes de déplacement direct.
Consommables tels queconseils, les navires et les plaques utilisés dans le flux de travail PCR ne doivent pas contenir de substances qui compromettent l'échantillon ou la falsification du résultat. Il s'agit notamment de l'ADN, des DNASE, des RNases et des inhibiteurs de PCR, ainsi que des composants qui peuvent potentiellement lixiviation du matériau pendant la réaction - substances appelées lixivières.
Erreur de l'utilisateur
Plus les échantillons sont traités, plus le risque d'erreur est élevé. Il peut facilement arriver qu'un échantillon soit pipené dans le mauvais navire ou le mauvais puits. Ce risque peut être considérablement réduit par un marquage facilement discernable des puits. Grâce à l'automatisation des étapes de distribution, le «facteur humain», c'est-à-dire, les erreurs et les variations liées à l'utilisateur, sont minimisées, augmentant ainsi la reproductibilité, en particulier dans le cas de petits volumes de réaction. Cela nécessite des plaques de stabilité dimensionnelle suffisante à utiliser dans un poste de travail. Les codes à barres attachés offrent une redabilité de la machine supplémentaire, ce qui simplifie le suivi des échantillons tout au long du processus.
Programmation du thermocycleur
La programmation d'un instrument peut s'avérer que beaucoup de temps et de sujets aux erreurs. Différentes fonctionnalités de PCR Thermal Cycler fonctionnent ensemble pour simplifier cette étape de processus et, surtout, pour la rendre sûre:
Un fonctionnement facile et un bon indicateur utilisateur sont la base d'une programmation efficace. S'appuyant sur cette fondation, l'administration des utilisateurs protégée par mot de passe empêchera ses propres programmes d'être modifiés par d'autres utilisateurs. Si plusieurs cycleurs (du même type) sont utilisés, il est bénéfique si un programme peut être transféré directement d'un instrument à un autre via USB ou connectivité. Le logiciel informatique permet une administration centrale et sécurisée de programmes, de droits des utilisateurs et de documents sur un ordinateur.
PCR
Pendant la course, l'ADN est amplifié dans le récipient de réaction, où chaque échantillon doit être soumis à des conditions de réaction identiques et cohérentes. Les aspects suivants sont pertinents pour le processus:
Contrôle de la température
Une excellente précision dans le contrôle de la température et l'homogénéité du bloc Cycler sont la base du conditionnement uniforme de la température de tous les échantillons. La haute qualité des éléments de chauffage et de refroidissement (éléments de Peltier), ainsi que la façon dont ceux-ci sont connectés au bloc, sont les facteurs décisifs qui détermineront le risque de divergences de température appelés «effet de bord»
Évaporation
Les concentrations des composantes de réaction individuelles ne devraient pas changer au cours de la réaction due à l'évaporation. Sinon, il est possible que très peuProduit PCRpeut être généré, ou aucun du tout. Il est donc crucial de minimiser l'évaporation en assurant un sceau sécurisé. Dans ce cas, le couvercle chauffé du thermocycleur et le sceau du navire travaillent main dans la main. Différentes options d'étanchéité sont disponibles pourPlaques de PCR (lien: article d'étanchéité), par lequel le meilleur sceau est atteint par scellage de chaleur. D'autres fermetures peuvent également convenir, tant que la pression de contact du couvercle du cycleur peut être ajustée au joint sélectionné.
La normalisation du processus est en place afin de protéger les résultats précis et reproductibles à long terme. Cela comprend un entretien régulier de l'équipement pour s'assurer qu'il est toujours en bon état de fonctionnement. Tous les consommables doivent être de qualité constante sur tous les lots produits, et leur disponibilité fiable doit être garantie.
Heure du poste: novembre 29-2022