La standardisation des processus comprend leur optimisation, puis leur établissement et leur harmonisation, permettant ainsi des performances optimales à long terme – indépendamment de l'utilisateur. La standardisation garantit des résultats de haute qualité, ainsi que leur reproductibilité et comparabilité.
L’objectif de la PCR (classique) est de générer un résultat fiable et reproductible. Pour certaines applications, le rendement duProduit PCRest également pertinent. Pour ces réactions, il faut veiller à ce que les échantillons ne soient pas compromis et que le flux de travail PCR reste stable. Concrètement, cela se traduit par la minimisation de l’introduction de contaminations qui pourraient conduire à des résultats faussement positifs ou faussement négatifs, voire inhiber la réaction PCR. De plus, les conditions de réaction doivent être aussi identiques que possible pour chaque échantillon individuel au sein d'un essai et également être transférables aux réactions ultérieures (de la même méthode). Cela fait référence à la composition des réactions ainsi qu'au type de contrôle de la température dans le cycleur. Bien entendu, les erreurs des utilisateurs doivent être évitées autant que possible.
Ci-dessous, nous démontrerons les défis rencontrés lors de la préparation et tout au long de l’exécution d’un PCR – ainsi que les approches de solutions qui existent en ce qui concerne les instruments et consommables utilisés pour la standardisation des flux de travail PCR.
Préparation de la réaction
La distribution des composants réactionnels dans des récipients PCR, ou des plaques, respectivement, comporte de multiples défis qui doivent être surmontés :
Conditions de réaction
Le dosage exact et précis des différents composants est indispensable pour obtenir des conditions de réaction les plus identiques possibles. Outre une bonne technique de pipetage, le choix du bon outil est essentiel. Les master-mix PCR contiennent fréquemment des substances qui augmentent la viscosité ou génèrent de la mousse. Pendant le processus de pipetage, ceux-ci entraînent un mouillage important dupointes de pipettes, réduisant ainsi la précision du pipetage. L’utilisation de systèmes de distribution directe ou d’embouts de pipettes alternatifs moins sujets au mouillage peut améliorer l’exactitude et la précision du processus de pipetage.
Contaminations
Au cours du processus de distribution, des aérosols sont générés qui, s’ils atteignent l’intérieur de la pipette, peuvent potentiellement contaminer un autre échantillon lors de l’étape de pipetage suivante. Cela peut être évité en utilisant des pointes de filtre ou des systèmes à déplacement direct.
Consommables tels queconseils, les récipients et les plaques utilisés dans le flux de travail PCR ne doivent pas contenir de substances susceptibles de compromettre l'échantillon ou de fausser le résultat. Il s’agit notamment de l’ADN, des DNases, des RNases et des inhibiteurs de PCR, ainsi que des composants susceptibles de s’échapper du matériau au cours de la réaction – substances appelées lixiviables.
Erreur de l'utilisateur
Plus les échantillons sont traités, plus le risque d’erreur est élevé. Il peut facilement arriver qu’un échantillon soit pipeté dans le mauvais récipient ou dans le mauvais puits. Ce risque peut être considérablement réduit par un marquage facilement visible des puits. Grâce à l'automatisation des étapes de distribution, le « facteur humain », c'est-à-dire les erreurs et les variations liées à l'utilisateur, est minimisé, augmentant ainsi la reproductibilité, notamment dans le cas de petits volumes de réaction. Cela nécessite des plaques présentant une stabilité dimensionnelle suffisante pour être utilisées dans un poste de travail. Les codes-barres joints offrent une lisibilité machine supplémentaire, ce qui simplifie le suivi des échantillons tout au long du processus.
Programmation du thermocycleur
La programmation d’un instrument peut s’avérer fastidieuse et sujette aux erreurs. Différentes fonctionnalités du thermocycleur PCR fonctionnent ensemble pour simplifier cette étape du processus et, surtout, pour la rendre sûre :
Une utilisation simple et un bon guidage de l'utilisateur sont la base d'une programmation efficace. S'appuyant sur cette base, une gestion des utilisateurs protégée par mot de passe empêchera que ses propres programmes soient modifiés par d'autres utilisateurs. Si plusieurs cycleurs (du même type) sont utilisés, il est avantageux qu'un programme puisse être transféré directement d'un instrument à un autre via USB ou connectivité. Les logiciels informatiques permettent une administration centralisée et sécurisée des programmes, des droits d'utilisateur et des documents sur un ordinateur.
Analyse PCR
Pendant l'analyse, l'ADN est amplifié dans le récipient de réaction, où chaque échantillon doit être soumis à des conditions de réaction identiques et cohérentes. Les aspects suivants sont pertinents pour le processus :
Contrôle de la température
L’excellente précision du contrôle de la température et l’homogénéité du bloc cycleur constituent la base d’un conditionnement à température uniforme de tous les échantillons. La haute qualité des éléments chauffants et refroidissants (éléments Peltier), ainsi que la manière dont ceux-ci sont connectés au bloc, sont des facteurs déterminants qui détermineront le risque d'écarts de température appelés « effet de bord ».
Évaporation
Les concentrations des différents composants de la réaction ne doivent pas changer au cours de la réaction en raison de l'évaporation. Sinon, il est possible que très peuProduit PCRpeut être généré, voire aucun. Il est donc crucial de minimiser l’évaporation en assurant une étanchéité sécurisée. Dans ce cas, le couvercle chauffant du thermocycleur et le joint de la cuve travaillent main dans la main. Différentes options d'étanchéité sont disponibles pourPlaques PCR (lien : article sur le scellement), la meilleure étanchéité étant obtenue grâce au thermoscellage. D'autres fermetures peuvent également convenir, à condition que la pression de contact du couvercle du cycleur puisse être ajustée au joint choisi.
La standardisation des processus est en place afin de garantir des résultats précis et reproductibles à long terme. Cela comprend un entretien régulier de l'équipement pour garantir qu'il est toujours en bon état de fonctionnement. Tous les consommables doivent être de haute qualité constante sur tous les lots produits, et leur disponibilité fiable doit être garantie.
Heure de publication : 29 novembre 2022