Introduction
Qu’est-ce que l’extraction d’acide nucléique ?
En termes très simples, l’extraction d’acide nucléique consiste à éliminer l’ARN et/ou l’ADN d’un échantillon et tout l’excès qui n’est pas nécessaire. Le processus d'extraction isole les acides nucléiques d'un échantillon et les produit sous la forme d'un éluat concentré, exempt de diluants et de contaminants susceptibles d'affecter les applications en aval.
Applications de l’extraction d’acide nucléique
Les acides nucléiques purifiés sont utilisés dans une multitude d’applications différentes, couvrant plusieurs industries différentes. Les soins de santé sont peut-être le domaine où il est le plus utilisé, l’ARN et l’ADN purifiés étant nécessaires à une multitude de tests différents.
Les applications de l’extraction d’acide nucléique dans le domaine de la santé comprennent :
- Séquençage de nouvelle génération (NGS)
- Génotypage SNP basé sur l'amplification
- Génotypage basé sur des matrices
- Digestion enzymatique de restriction
- Analyses utilisant des enzymes modificatrices (par exemple ligature et clonage)
Il existe également d'autres domaines au-delà des soins de santé où l'extraction d'acide nucléique est utilisée, notamment les tests de paternité, la médecine légale et la génomique.
Une brève histoire de l’extraction d’acide nucléique
Extraction d'ADNremonte à loin, le premier isolement connu ayant été réalisé par un médecin suisse nommé Friedrich Miescher en 1869. Miescher espérait résoudre les principes fondamentaux de la vie en déterminant la composition chimique des cellules. Après avoir échoué avec les lymphocytes, il a pu obtenir un précipité brut d'ADN à partir de leucocytes trouvés dans le pus des bandages jetés. Il l'a fait en ajoutant de l'acide puis un alcali à la cellule pour quitter le cytoplasme de la cellule, puis a développé un protocole pour séparer l'ADN des autres protéines.
À la suite des recherches révolutionnaires de Miescher, de nombreux autres scientifiques ont progressé et développé des techniques pour isoler et purifier l'ADN. Edwin Joseph Cohn, un spécialiste des protéines, a développé de nombreuses techniques de purification des protéines pendant la Seconde Guerre mondiale. Il était responsable de l’isolement de la fraction sérum-albumine du plasma sanguin, qui est importante pour maintenir la pression osmotique dans les vaisseaux sanguins. C’était crucial pour maintenir les soldats en vie.
En 1953, Francis Crick, avec Rosalind Franklin et James Watson, ont déterminé la structure de l'ADN, montrant qu'il était constitué de deux brins de longues chaînes de nucléotides d'acide nucléique. Cette découverte révolutionnaire a ouvert la voie à Meselson et Stahl, qui ont pu développer un protocole de centrifugation sur gradient de densité pour isoler l'ADN des bactéries E. Coli en démontrant la réplication semi-conservatrice de l'ADN au cours de leur expérience de 1958.
Techniques d'extraction d'acide nucléique
Quelles sont les 4 étapes de l’extraction de l’ADN ?
Toutes les méthodes d’extraction se résument aux mêmes étapes fondamentales.
Perturbation cellulaire. Cette étape, également appelée lyse cellulaire, consiste à briser la paroi cellulaire et/ou la membrane cellulaire, afin de libérer les fluides intra-cellulaires contenant les acides nucléiques d'intérêt.
Enlèvement des débris indésirables. Cela inclut les lipides membranaires, les protéines et autres acides nucléiques indésirables qui peuvent interférer avec les applications en aval.
Isolement. Il existe différentes manières d'isoler les acides nucléiques d'intérêt du lysat clarifié que vous avez créé, qui se répartissent en deux catégories principales : à base de solution ou à l'état solide (voir la section suivante).
Concentration. Une fois que les acides nucléiques ont été isolés de tous les autres contaminants et diluants, ils sont présentés dans un éluat hautement concentré.
Les deux types d'extraction
Il existe deux types d’extraction d’acide nucléique : les méthodes basées sur une solution et les méthodes à l’état solide. La méthode basée sur une solution est également connue sous le nom de méthode d’extraction chimique, car elle implique l’utilisation de produits chimiques pour décomposer la cellule et accéder au matériel nucléique. Cela peut utiliser soit des composés organiques tels que le phénol et le chloroforme, soit des composés inorganiques moins nocifs et donc plus recommandés tels que la protéinase K ou le gel de silice.
Voici des exemples de différentes méthodes d’extraction chimique pour décomposer une cellule :
- Rupture osmotique de la membrane
- Digestion enzymatique de la paroi cellulaire
- Solubilisation de la membrane
- Avec des détergents
- Avec traitement alcalin
Les techniques du solide, également appelées méthodes mécaniques, consistent à exploiter la manière dont l’ADN interagit avec un substrat solide. En sélectionnant une bille ou une molécule sur laquelle l’ADN se liera mais pas l’analyte, il est possible de séparer les deux. Exemples de techniques d'extraction en phase solide, notamment l'utilisation de silice et de billes magnétiques.
Extraction de billes magnétiques expliquée
La méthode d’extraction de billes magnétiques
Le potentiel d'extraction à l'aide de billes magnétiques a été reconnu pour la première fois dans un brevet américain déposé par Trevor Hawkins, pour l'institut de recherche du Whitehead Institute. Ce brevet reconnaissait qu'il était possible d'extraire du matériel génétique en le liant à un support solide, qui pourrait être une bille magnétique. Le principe est d'utiliser une bille magnétique hautement fonctionnalisée sur laquelle va se fixer le matériel génétique, qui pourra ensuite être séparé du surnageant en appliquant une force magnétique à l'extérieur du récipient contenant l'échantillon.
Pourquoi utiliser l’extraction de billes magnétiques ?
La technologie d’extraction par billes magnétiques est de plus en plus répandue, en raison du potentiel qu’elle offre pour des procédures d’extraction rapides et efficaces. Ces derniers temps, des billes magnétiques hautement fonctionnalisées dotées de systèmes tampons appropriés ont été développées, ce qui a rendu possible l'automatisation de l'extraction des acides nucléiques et un flux de travail très léger et rentable. De plus, les méthodes d’extraction par billes magnétiques n’impliquent pas les étapes de centrifugation qui peuvent provoquer des forces de cisaillement qui brisent des morceaux d’ADN plus longs. Cela signifie que les brins d’ADN les plus longs restent intacts, ce qui est important dans les tests génomiques.
Heure de publication : 25 novembre 2022