Onnistuneiden monistusreaktioiden kannalta on välttämätöntä, että yksittäiset reaktiokomponentit ovat läsnä oikeassa pitoisuudessa kussakin valmisteessa. Lisäksi on tärkeää, ettei kontaminaatiota tapahdu.
Varsinkin kun on saatava aikaan monia reaktioita, on päätetty valmistaa ns. master-seos sen sijaan, että jokainen reagenssi pipetoidaan erikseen kuhunkin astiaan. Kaupallisesti on saatavilla esikonfiguroituja seoksia, joihin lisätään vain näytekohtaisia komponentteja (pohjustetta) ja vettä. Vaihtoehtoisesti voit valmistaa master-seoksen itse. Molemmissa varianteissa seos jaetaan jokaiseen PCR-astiaan ilman templaattia ja yksittäinen DNA-näyte lisätään erikseen lopussa.
Pääseoksen käyttämisellä on useita etuja: Ensinnäkin yksittäisten pipetointivaiheiden määrä vähenee. Tällä tavalla sekä käyttäjävirheiden riski pipetoinnin aikana että kontaminaatioriski minimoidaan ja tietysti aikaa säästyy. Periaatteessa myös pipetointitarkkuus on suurempi, koska annostellaan suurempia määriä. Tämä on helppo ymmärtää pipettien teknisiä tietoja tarkasteltaessa: Mitä pienempi annostelutilavuus, sitä suurempia poikkeamia voi olla. Se, että kaikki valmisteet tulevat samasta astiasta, vaikuttaa positiivisesti homogeenisuuteen (jos se on hyvin sekoitettu). Tämä parantaa myös kokeiden toistettavuutta.
Master-seosta valmistettaessa tulee lisätä vähintään 10 % lisätilavuutta (esim. jos tarvitaan 10 valmistetta, lasketaan 11:n perusteella), jotta viimeinenkin astia täyttyy kunnolla. Tällä tavalla voidaan kompensoida (pienet) pipetoinnin epätarkkuudet ja näytehäviön vaikutus pesuainetta sisältävien liuosten annostelussa. Entsyymiliuoksissa, kuten polymeraaseissa ja master-seoksissa on pesuaineita, jotka aiheuttavat vaahtoa ja jäämiä normaalin sisäpinnalle.pipetin kärjet.
Sovelluksesta ja annosteltavan nesteen tyypistä riippuen on valittava oikea pipetointitekniikka (1) ja valittava sopiva laitteisto. Pesuaineita sisältäville liuoksille suositellaan suoran syrjäytysjärjestelmää tai niin kutsuttuja "low-retention" pipetin kärkiä vaihtoehtona ilmatyynypipeteille. VaikutusACE PIPETTE -kärkiperustuu erityisen hydrofobiseen pintaan. Pesuaineita sisältävät nesteet eivät jätä jäännöskalvoa sisä- tai ulkopuolelle, joten liuoksen hävikki voidaan minimoida.
Kaikkien komponenttien tarkan annostelun lisäksi on myös tärkeää, että valmisteet eivät saastu. Ei riitä, että käytetään erittäin puhtaita kulutusosia, koska pipetointiprosessi ilmatyynypipetissä voi tuottaa aerosoleja, jotka jäävät pipettiin. Aerosoliin mahdollisesti sisältyvä DNA voidaan siirtää näytteestä toiseen seuraavassa pipetointivaiheessa ja johtaa siten kontaminaatioon. Edellä mainitut suorasiirtojärjestelmät voivat myös minimoida tämän riskin. Ilmatyynypipettien kohdalla on järkevää käyttää suodatinkärkiä pipetin kartion suojaamiseen pitämällä roiskeita, aerosoleja ja biomolekyylejä.
Postitusaika: 06.12.2022