Onnistuneiden monistusreaktioiden saavuttamiseksi on välttämätöntä, että yksittäiset reaktiokomponentit ovat läsnä oikeassa pitoisuudessa jokaisessa valmistuksessa. Lisäksi on tärkeää, että saastumista ei tapahdu.
Varsinkin kun monia reaktioita on perustettava, se on perustettu valmistelemaan ns. Master-seos sen sijaan, että piiputtaa jokainen reagenssi erikseen jokaiseen astiaan. Esiasetettuja seoksia on saatavana kaupallisesti, joihin lisätään vain näytekohtaisia komponentteja (pohjamaalia) ja vettä. Vaihtoehtoisesti Master -sekoitus voidaan valmistaa itse. Molemmissa muunnelmissa seos jakautuu jokaiselle PCR -astialle ilman templaattia ja yksittäinen DNA -näyte lisätään erikseen lopussa.
Master -sekoituksen avulla on useita etuja: ensinnäkin yksittäisten pipetointivaiheiden lukumäärä vähenee. Tällä tavoin sekä käyttäjävirheiden riski pipetoinnin aikana että saastumisriski minimoidaan ja tietysti aika säästää. Periaatteessa pipetointitarkkuus on myös suurempi, koska suuret tilavuudet on annettu. Tämä on helppo ymmärtää tarkistettaessa pipettien teknisiä tietoja: Mitä pienempi annostettu tilavuus, sitä korkeampi poikkeamat voivat olla. Sillä, että kaikki valmistelut tulevat samasta astiasta, on positiivinen vaikutus homogeenisuuteen (jos hyvin sekoitettu). Tämä parantaa myös kokeiden toistettavuutta.
Pääsekoitusta valmistettaessa on lisättävä vähintään 10 % ylimääräistä tilavuutta (esim. Jos vaaditaan 10 valmistelua, lasketaan 11: n perusteella), jotta jopa viimeinen alus täyttyy kunnolla. Tällä tavoin (vähäinen) epätarkkuuksien pipetointi ja näytteen menetyksen vaikutus, kun pesuainetta sisältäviä ratkaisuja annostetaan. Pesuaineet sisältävät entsyymiliuokset, kuten polymeraasit ja master -seokset, aiheuttaen vaahdon muodostumisen ja jäännökset normaalin sisäpinnallapipettivinkit.
Levityksestä ja annostettavasta nestetyypistä riippuen oikea pipetustekniikka (1) on valittava ja valittava asianmukainen laite. Pesuainetta sisältäville liuoksille suositellaan suoraa siirtymäjärjestelmää tai ns. ”Matalan pidättämistä” -pipettivinkkejä vaihtoehtona ilmatyynypipetteille. VaikutusCe -pipetin kärkiperustuu erityisen hydrofobiseen pintaan. Pesuaineet sisältävät nesteet eivät jätä jäännöskalvoa sisä- ja ulkopuolelle, jotta liuoksen menetys voidaan minimoida.
Kaikkien komponenttien tarkan annostelun lisäksi on myös tärkeää, että valmisteiden saastumista ei tapahdu. Ei riitä käyttää korkean puhtauden tarvikkeita, koska ilmatyynypipetin pipetointiprosessi voi tuottaa pipektissä jääviä aerosoleja. Aerosoliin sisältyvä DNA voidaan siirtää yhdestä näytteestä seuraavaan seuraavassa pipetointivaiheessa ja johtaa siten saastumiseen. Edellä mainitut suorat siirtymäjärjestelmät voivat myös minimoida tämän riskin. Ilmatyynypipetteissä on järkevää käyttää suodatinvinkkejä pipettikartion suojaamiseen säilyttämällä roiskeet, aerosolit ja biomolekyylit.
Viestin aika: joulukuu-06-2022